Monoclonal Antibody Charge Variants Identification by Fully Automated Capillary Isoelectric Focusing – Mass Spectrometry

Význam tématu

Heterogenita nábojových variant monoklonálních protilátek je klíčovým parametrem pro bezpečnost a účinnost bioterapeutik. Řízená separace a identifikace těchto variant umožňuje detailní kvalitativní i kvantitativní kontrolu v průmyslové výrobě a výzkumu.

Cíle a přehled studie

Cílem této studie je prezentovat plně automatizovanou metodu k analýze a přímé hmotnostní spektrometrické identifikaci nábojových variant monoklonálních protilátek pomocí on-line spojení kapilární izoelektrické fokuse a MS. Pracovní postup je založen na systému Agilent 7100A CE s iontovým zdrojem CMP Scientific EMASS-II a TOF/Q-TOF hmotnostních spektrometrech Agilent 6230 a 6545.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda kombinuje chemickou mobilizaci pH gradientu v dlouhé PS1 kapiláře (75 cm, 30 µm tip) s elektrospray ionizací. Použité roztoky:

• Anolyte: 1 % kyselina mravenčí v 15 % glycerolu
• Catholyte: 0,2 N NH4OH v 15 % glycerolu
• Sheath liquid: 20 % kyselina octová, 25 % acetonitril
• Vzorek: monoklonální protilátka v 5 mM NH4Ac, 1–1,5 % Pharmalyte, 15 % glycerol

Separace probíhá při napětí 15–30 kV, tlakové injekci 5–10 mbar a ESI napětí 2,2–2,4 kV. MS parametry: Vcap 0 V, fragmentor 380 V, sušící plyn 6 l/min při 365 °C.

Hlavní výsledky a diskuse

Systém prokázal vysokou reprodukovatelnost a selektivitu při testech s modelovými proteiny (lysozym, ribonukleáza) a s referenčním SigmaMAb standardem. Analýza daratumumabu odhalila jednu základní variantu (N-terminální pyroglutamát) a dvě kyselé varianty (deamidace, glykace lysinu). Opakované injekce ukázaly RSD relativních migračních časů pod 6 %.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje:

• Přímou identifikaci intaktních nábojových variant bez frakční sběru
• Vysoké rozlišení izoelektrických forem
• Automatizované workflow vhodné pro rutinní QA/QC a výzkum

Budoucí trendy a možnosti využití

Dále lze aplikovat na rozšířenou charakterizaci glykosylace, variant oligosacharidů nebo používat negativní ionizační režimy pro kyselé biomolekuly. Integrace s vyšší automatizací a multi-hmatními platformami otevře nové možnosti high-throughput analýzy bioterapeutik.

Závěr

Plně automatizovaný CIEF-MS postup na bázi Agilent-CMP systému nabízí efektivní platformu pro detailní rozbor nábojové heterogenity mAb. Workflow kombinuje vysokou separační účinnost, senzitivitu MS a jednoduchou obsluhu, což podporuje jeho nasazení v bioprodukci i výzkumu.

Reference

1. Zhu G, Sun L, Dovichi NJ. Simplified Capillary Isoelectric Focusing with Chemical Mobilization for Intact Protein Analysis. J Sep Sci. 2017;40(4):948–953.
2. Dai J et al. Capillary Isoelectric Focusing-Mass Spectrometry Method for the Separation and Online Characterization of Intact Monoclonal Antibody Charge Variants. Anal Chem. 2018;90(3).
3. Dai J, Zhang Y. A Middle-Up Approach with Online Capillary Isoelectric Focusing/Mass Spectrometry for In-Depth Characterization of Cetuximab Charge Heterogeneity. Anal Chem. 2018;90(24):14527–14534.
4. Ouyang Y et al. Negative-Ion Mode Capillary Isoelectric Focusing Mass Spectrometry for Charge-Based Separation of Acidic Oligosaccharides. Anal Chem. 2019;91(1):846–853.