Comparison of Different Brands of Carrier Ampholytes for Monoclonal Antibody Charge Heterogeneity Analysis by Capillary Isoelectric Focusing

Význam tématu

Capilární izoelektrické fokusování (cIEF) je klíčová metoda pro charakterizaci nábojoch heterogenity proteinů, zejména monoklonálních protilátek (mAb). Díky vysokému rozlišení a nízké spotřebě vzorku umožňuje spolehlivé rozlišení isoform s minimální časovou náročností.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikace bylo porovnat výkonnost čtyř komerčně dostupných značek širokopásmových (pH 3–10) nosičových amfolytů (Pharmalyte, HR AESlyte, SH AESlyte, Servalyt) pro vysokorozlišovací cIEF analýzu nábojoch heterogenity mAb na fluorokarbonem potažených kapilárách.

Použitá metodika a instrumentace

V metodě byly použity:

• Agilent 7100 Capillary Electrophoresis System s externí vodní lázní (6 °C) a detekcí UV při 280 nm
• Fluorokarbonem potažené kapiláry µSIL-FC, ID 50 μm, efektivní délka 16 cm
• Amfolyty: Pharmalyte 3–10 (GE Healthcare), HR AESlyte 3–10 a SH AESlyte 3–10 (Advanced Electrophoresis Solutions), Servalyt 3–10 (Serva)
• Stabilizátory: L-arginin (kathodický), iminodiacetová kyselina (anodický)
• Další reagencie: methylcelulóza, močovina, Tris/HCl, kyselina octová, NaOH

Příprava vzorku zahrnovala desalting mAb (konc. 3,7 mg/mL) a míchání s optimalizovanou koncentrací amfolytů podle typu CA.

Hlavní výsledky a diskuse

Porovnání značek odhalilo:

• CA-specifické pozadí: nejnižší u Pharmalyte a HR AESlyte, zvýšené u SH AESlyte a nejvyšší u Servalyt
• Rozlišení isoform mAb (pH 6–7): Pharmalyte a HR AESlyte podobné, SH AESlyte mírně lepší rozlišení středních isoform, Servalyt nejlepší celkové rozlišení (9 isoform) za cenu vyššího pozadí
• Mezivariabilita pI a relativní plochy: u všech značek pI s RSD <0,1 %, relativní plochy u Pharmalyte a HR AESlyte <3 % RSD, u SH AESlyte a Servalyt <9 % RSD (s jednou výjimkou Servalyt isoformy 7 ~14 % RSD)

Výsledky potvrzují, že správná volba CA ovlivňuje kvalitu separace a přesnost integrace dat.

Přínosy a praktické využití metody

Vysokorozlišovací cIEF na fluorokarbonem potažených kapilárách nabízí:

• Rychlou a reprodukovatelnou analýzu nábojoch heterogenity mAb
• Volbu mezi nižším šumem pozadí (Pharmalyte, HR AESlyte) nebo maximálním rozlišením (Servalyt) podle aplikačních potřeb
• Vysokou stabilitu kapilár a nízkou spotřebu vzorku

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje zahrnují:

• Optimalizaci složení amfolytů pro specifické pH oblasti
• Integraci cIEF s hmotnostní spektrometrií pro identifikaci isoform
• Využití nových povlaků kapilár pro minimalizaci pozadí a prodloužení životnosti
• Microfluidické platformy pro high-throughput screening

Závěr

Studie ukazuje, že všechny testované amfolyty umožňují spolehlivou cIEF analýzu mAb, přičemž volba značky se řídí preferencí mezi nízkým CA-specifickým pozadím (Pharmalyte, HR AESlyte) a nejvyšším rozlišením (Servalyt). Fluorokarbonem potažené kapiláry přidávají metodě výjimečnou stabilitu a reprodukovatelnost.

Reference

• Zhao S. S., Chen D. D. Y. Applications of capillary electrophoresis in characterizing recombinant protein therapeutics. Electrophoresis 2014, 35, 96–108.
• Kristle T. et al. Principles and applications of capillary isoelectric focusing. Agilent Technologies Primer 2014, 5991-16660EN.
• Righetti P. G. et al. Carrier ampholytes for IEF: The verdict after forty years. Electrophoresis 2007, 28, 3799–3810.
• Mack S. et al. Systematic study in CIEF: Defining and optimizing parameters critical to reproducibility and robustness. Electrophoresis 2009, 30, 4049–4058.
• Salas-Solano O. et al. Intercompany study to evaluate robustness of cIEF for monoclonal antibodies. Chromatographia 2011, 73, 1137–1144.
• Wenz C. Monoclonal Antibody Charge Heterogeneity Analysis by cIEF on Agilent 7100. Agilent Technologies Application Note 2012, 5991-1142EN.
• Wenz C. Monoclonal Antibody Charge Heterogeneity Analysis by cIEF on Fluorocarbon Coated Capillaries. Agilent Technologies Application Note 2013, 5991-2885EN.