Maximize productivity in proteome profiling

Význam tématu

Deep-dive proteomika využívající nanoLC-MS se řadí mezi klíčové metody pro detailní charakterizaci komplexních proteomických vzorků. Tradiční dlouhé kolony a nízké průtoky zvyšují rozlišení a citlivost, avšak vedou k pomalým migracím analytu a nízké procentuální vytíženosti MS během sekvenčních kroků nanesení, separace, mytí a ekvilibrace. Zvýšení produktivity a využití MS je zásadní pro náročné aplikace v akademickém i průmyslovém výzkumu, kde klíčovou roli hrají rychlost, reprodukovatelnost a celková kapacita analýzy.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo navrhnout a otestovat jednoduchý, robustní tandem nanoLC-MS systém s inteligentním řízením gradientů a novým dvojitým nano-ESI zdrojem, který umožní maximální, téměř 100% vytíženost MS. Systém kombinuje dvě oddělené analytické cesty, které se střídavě plní a vysílají separované analyty do hmotového spektrometru, čímž odstraňuje mrtvý čas mezi běhy.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorkem byl komerčně dostupný HeLa protein digest o koncentraci 200 ng na injekci. Pro separaci a ionizaci byly použity:

• UltiMate 3000 RSLCnano sestávající z NCS-3500RS a NCP-3200RS pump, WPS-3000TPL RS autosampler
• Sonation double-barrel column oven pro dvojité nano ESI
• Nanospray Flex ion source s dvojitou UHPLC liquid junction a vysokonapěťovým přepínáním
• Q Exactive HF-X hmotový spektrometr s DDA režimem (MS1 60 000, MS2 15 000 rozlišení)
• Samošířitelné nanoViper kapiláry, Evotec vlastní C18 kolony 75 µm × 40 cm a předkolony PepMap 100 pro trap-and-elute

Řízení metod probíhalo inteligentními skripty, které automaticky synchronizují přepínání sloupců, vysokého napětí a pump.

Hlavní výsledky a diskuse

Tandem nanoLC-MS při 90min gradientu dosáhl konzistentně přes 73 000 identifikovaných peptidů a více než 6 100 proteinových skupin z každé kolony. Vytíženost MS se zvýšila z 51 % na 98 %, což umožnilo nárůst denní produktivity ze 8 na 14 vzorků. Mezi běhy na stejném i na alternujících sloupcích byla vysoká reprodukovatelnost: 90 % peptidů se objevilo ve všech analýzách a 99 % mělo variaci retenčního času menší než 1 min. Proteomické kvantifikace vykázaly u 93 % proteinů rozptyl nižší než 25 %. Šablonové metody pro různé délky gradientu lze dále přizpůsobit parametrům mytí, ekvilibrace a složení gradientních kroků.

Přínosy a praktické využití metody

Nové tandem nanoLC-MS řešení přináší:

• Maximální využití hmotového spektrometru bez mrtvých časů
• Snížení post-kolonové disperze díky absenci nadbytečných spojek
• Zvýšenou reprodukovatelnost mezi kolony díky jedné pumpě pro oba dejky
• Jednoduchou sekvenční přípravu díky inteligentnímu nastavování LC metod
• Kompatibilitu s direct injection i trap-and-elute přístupy

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje zahrnují:

• Využití kratších gradientů pro vysokopropustné srovnávací studie
• Integraci prediktivních algoritmů a umělé inteligence v plánování metod
• Rozšíření na multi-omics přístupy se synchronizovanou metabolomikou
• Nasazení v klinické a farmaceutické výzkumné praxi pro rychlou biomarkerovou validaci

Závěr

Navržený inteligentní tandem nanoLC-MS systém s dvojitým nano ESI zdrojem nabízí robustní řešení pro hlubokou proteomickou analýzu s téměř 100% vytížením MS. Jednoduché nastavení, vysoká reprodukovatelnost i flexibilita metod dělají z této koncepce výkonný nástroj pro akademické i průmyslové aplikace.

Reference

1. Pynn C.; Boychenko A.; Decrop W. a kol. Tandem nanoLC-MS: maximum MS utilization for deep-dive proteomic analysis. Thermo Scientific Tech Note 72899, 2020.
2. Sonation GmbH. Column Oven PRSO-V2 User Manual, verze 1.0, 2018.
3. R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, 2019.