Tandem nanoLC-MS: maximum MS utilization for deep-dive proteomic analysis

Význam tématu

UltiMate 3000 RSLCnano tandemní nanoLC MS metodika pomáhá maximalizovat využití hmotové spektrometrie v hluboké proteomice. V tradičním nanoLC MS je až 50 procent času MS neaktivní, kvůli proplachu kolon, ekvilibraci a přepouštění vzorku. Tandemní nanoLC umožňuje paralelní přípravu a eluci na dvou separačních cestách, čímž se redukuje prostoj a zvyšuje produktivita analýzy.

Cíle a přehled studie / článku

Metoda se zaměřuje na sestavení tandemní nanoLC MS soustavy s dvěma vysokotlakými gradientními pumpami a střídačem 1·32 nano ventil pro kontinuální dodávku vzorku k MS. Cílem je dosažení téměř 100 procentní doby akvizice dat MS pro hluboké proteomické analýzy HeLa proteomu.

Použitá metodika a instrumentace

• Platforma UltiMate 3000 RSLCnano v tandemní prekoncentrační konfiguraci s dvěma vysokotlakými pumpami NCS-3500RS a NCP-3200RS
• Autosampler WPS-3000TFC s upgradem na nano cap kit
• Diverzní 1·32 post kolonní ventil pro směřování eluátu buď do hmotového spektrometru nebo do odpadu
• Kolony Thermo Scientific Acclaim PepMap RSLC C18 o délce 50 cm, průměru 75 μm a velikosti částic 2 μm
• Hmotový spektrometr s ESI zdrojem Thermo Scientific Nanospray Flex a rozlišením MS1 60 000 a MS2 15 000
• Solventy LC MS grade voda, acetonitril, kyselina trifluoroctová a mravenčí
• Software Xcalibur pro akvizici a Chromeleon pro řízení instrumentace
• Datové zpracování s Proteome Discoverer a sekvenačním algoritmem Sequest HT

Hlavní výsledky a diskuse

Tandemní nanoLC MS přinesla téměř 100 procentní využití MS doby akvizice na 90 minutních gradientech. Retenční časy peptidů byly reprodukovatelné intra i interkolonově s odchylkami do 7 procent. Nárůst šířky chromatografických topů vlivem post kolonního ventilu byl minimální a neomezil identifikaci. Přenos vzorku do druhé kolony probíhal plynule bez ztráty informací. Carryover peptidů byl měřen pod 0,2 procenta. Počet proteinových skupin přesáhl 4200 při 1 μg HeLa digestu se stabilními hodnotami PSM a počtu peptidů napříč 22 opakovanými injekcemi.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšení produktivity nanoLC MS workflow až dvojnásobně díky paralelizaci přípravy kolony
• Snížení prostojů hmotového detektoru v důsledku kontinuální dodávky eluátu
• Odstranění kontaminantů pomocí diverzního ventilu během proplachu kolony
• Minimální carryover díky vysokoefektivnímu mytí vzorkové smyčky a trap kolony
• Vysoká reprodukovatelnost chromatografie i MS dat pro kvalitativní i kvantitativní proteomiku

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další optimalizace gradientních profilů pro zvládnutí širších retenčních oken a celkové zkrácení analýzy
• Implementace dalších operativních režimů jako multiplexing a multi notch DDA pro zvýšení hloubky analýzy
• Integrace s moderními iontovými zdroji a odlišnými MS technikami pro rozšířenou dynamiku
• Možnost použití přístroje v klinické proteomice, farmaceutické QA QC a biomarker screeningových studiích

Závěr

Tandemní nanoLC konfigurace na bázi UltiMate 3000 RSLCnano s využitím paralelních pump a post kolonního ventilu výrazně redukuje neproduktivní cykly LC MS analýzy. Metoda dosahuje téměř 100 procentní využití doby MS akvizice, nízké carryover a vysoké reprodukovatelnosti. Tento přístup představuje novou úroveň produktivity pro hlubokou proteomiku a otevírá dveře pro aplikace vyžadující vysokou propustnost a citlivost.

Reference

• Thermo Scientific UltiMate 3000 RSLCnano System Versatility and Performance the Ultimate Solution for All Separation Workflows BR 71898 2016
• Thermo Scientific UltiMate 3000 RSLCnano Standard Applications Guide v3 0 2018
• LC MS methods available in AppsLab thermofisher com App 4213 tandemnanolcms