Double Barrel ESI Source and Novel Tandem NanoLC-MS Setup Enables 24/7 Proteome Profiling with Close to 100% MS Utilization

Význam tématu

NanoLC-MS technologie představuje zlatý standard pro detailní proteomické analýzy díky vysoké citlivosti a selektivitě. Nicméně klasické nanoLC-MS systémy trpí nízkou využitelností hmotnostního spektrometru (MS), protože značná část doby se věnuje injekci, praní a ekvilibraci kolony místo získávání dat. Zvýšení MS využití je klíčové pro dosah hlubšího proteomického pokrytí, vyšší produktivitu a efektivní 24/7 provoz bez ztráty datového obsahu.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo navrhnout a ověřit tandem nanoLC-MS/MS platformu pro maximální využití MS (>95 %) a kontinuální provoz až 24/7. Práce kombinuje dva analytické nanoLC kanály se samostatnými kolónami, inteligentní „look ahead“ injekce a automatické přepínání kolony během běhu. Výsledkem je uživatelsky přímočaré rozhraní podobné standardním nanoLC sekvencím, ale s vysokou průchodností a bez kompromisů v chromatografickém rozlišení.

Použitá metodika a instrumentace

• Tandem Thermo Scientific UltiMate 3000 RSLCnano systém se dvěma paralelně pracujícími kolónami (75 µm × 40 cm, C18, 1,9 µm).
• Double Barrel Column Oven (Sonation GmbH) pro současné ovládání obou kolón.
• Thermo Scientific Q Exactive HF-X Hybrid Quadrupole-Orbitrap hmotnostní spektrometr.
• Pumpy NCS-3500RS pro gradientní dodávku a NCP-3200RS pro praní, ekvilibraci a načítání vzorku; WPS-3000TPL RS autosampler.
• Metoda „direct injection“ s 200 ng HeLa digestu, objem načítání 10–20 µL, průtok 250 nL/min, teplota 60 °C, délka gradientu 45–120 min.
• DDA režim, MS1 rozsah m/z 375–1500, data zpracována v Proteome Discoverer 2.4 s Sequest HT a 1 % FDR.

Hlavní výsledky a diskuse

Tandemní nanoLC-MS platforma dosahuje využití MS nad 95 % při gradientu 90 min. Za 24/7 provozu identifikovala přes 73 000 peptidů a 6 700 proteinových skupin na každé kolóně v opakovaných bězích. Systém generuje více než 800 identifikovaných peptidů za minutu měření. Mezi běhy byla dosažena shoda více než 90 % proteinů a 80 % peptidových skupin, retence peptidů vykazovala 96 % opakovatelnost s odchylkou pod 1 minutu, variabilita proteinové abundace byla ≤25 %. Platforma umožňuje plynulé přepínání kolón a paralelní praní a ekvilibraci bez vlivu na kvalitu separace.

Přínosy a praktické využití metody

Nová konfigurace nabízí vysokou datovou produktivitu a reprodukovatelnost, což je klíčové pro vysoce propustné proteomické laboratoře, farmaceutický výzkum, QA/QC a longitudinální studie. Snížení nevyužitého času MS zvyšuje počet získaných identifikací na jednotku času a umožňuje efektivní nepřetržitý provoz bez ztráty výkonu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Platforma lze dále rozšířit o cílené analýzy, kvantitativní metody s izotopově značenými standardy (TMT, SILAC) či hlubší mapování PTM (fosfoproteomika). Integrace automatizovaných skriptů pro adaptivní přepínání a umělé inteligence pro optimalizaci gradientů nabídne další nárůst využití a flexibilitu. Vývoj vícekanálových zdrojů ESI a vyššího paralelismu může vést k novým standardům v proteomice.

Závěr

Studie představuje úspěšné využití tandemního nanoLC-MS systému a double barrel ESI zdroje pro téměř stoprocentní využití MS. Systém dosahuje vysoké hloubky proteomu, vynikající reprodukovatelnosti a podporuje 24/7 provoz, čímž nastavuje nový standard pro rychlé a citlivé proteomické analýzy.

Reference

1. RSLCnano pre-concentration nano LC kit (P/N 6720.0310) v UltiMate 3000 RSLCnano Standard Applications Guide.
2. Pynn C., Boychenko A., Decrop R., Baynham M., Jehle P., Ruehl M. Tandem nanoLC-MS: maximum MS utilization for deep-dive proteomic analysis. TN 72899.
3. R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria, 2019.