Maximizing sample throughput and sensitivity in nano- and capillary-LC-MS

Význam tématu

Analýza proteomů pomocí nano- a kapilární LC-MS představuje zlatý standard pro hluboký průzkum proteomu díky vynikající citlivosti a chromatografickému rozlišení. Zároveň však trpí nízkou produktivitou vlivem dlouhých kroků nahrávání vzorku, migrace analytů a kroků mytí a ekvilibrace. Optimalizace tohoto procesu je klíčová pro zvýšení využití hmotnostního spektrometru a efektivnější analýzu velkých souborů vzorků v proteomice.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo představit a ověřit novou tandemovou metodu přímé injekce (TDI) využívající dva paralelní analytické sloupce a dvojici pump na systému Thermo Scientific™ Vanquish™ Neo UHPLC. Metoda má umožnit téměř nepřetržitý tok vzorku do MS, maximalizovat využití spektrometru a zkrátit dobu cyklů bez kompromisů na citlivosti a rozlišení.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky:

• HeLa Digest/PRTC Standard (10 µg/vial), TMTpro 18-plex značené vzorky
• Formic acid, acetonitril, isopropanol v LC/MS grade kvalitě

LC-MS setup:

• Thermo Scientific Vanquish Neo UHPLC se dvěma Binary Pump N (separační a recond pumpa)
• Vanquish Column Compartment N s dvojicí 2p-6p low-dispersion ventilů
• Sonation Double Barrel Oven pro dva paralelní nanoViper™ sloupce
• Thermo Scientific Nanospray Flex ion source s inteligentním přepínáním napětí
• Orbitrap Exploris 480 MS nebo Orbitrap Astral MS pro DDA a DIA akvizici

Data processing:

• Proteome Discoverer 3.1 se SEQUEST™ HT, INFERYS™ a CHIMERYS™
• Spectronaut 19 pro DIA data

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace metody:

• Zvýšení MS využití z ~70 % na >90 % při 250 nL/min, 90 min gradientu na 75 µm×75 cm sloupci
• Zkrácení cyklů z 90 min na 50 min bez ztráty kvality identifikací
• Možnost průtoku 12 až 180 vzorků/den podle délky gradientu a průtoku (0,1–5 µL/min)

Výkon proteomiky:

• Deep-dive TMTpro 18-plex: >6 700 proteinových skupin v 360 min gradientu, 72 vzorků/den
• High-throughput LFQ-DDA: ~2 600 proteinových skupin z 5 ng vzorku při 36 vzorcích/den, 100 nL/min
• DIA na Orbitrap Astral: ~10 000 proteinových skupin při 96 vzorcích/den na 75 µm×20 cm sloupci

Nízký carryover:

• Automatické mycí profily (isokratický, trapezoidní, obdélníkový, trojúhelníkový)
• Carryover pod 0,01 % v TMT-DDA a ~0,006 % v LFQ-DIA metodách

Kompatibilita:

• Komernčně dostupné PepMap™ Neo kolony i uživatelské (self-packed, pulled-tip) 75 µm kolony
• Rovnoměrné výsledky mezi sloupci s minimálními rozdíly ovlivňujícími biologickou interpretaci

Přínosy a praktické využití metody

Metoda TDI:

• Vysoká propustnost a citlivost pro rozsáhlé studie proteomů
• Vhodné pro SCoPE-MS, single-cell a nízkokoncentrované vzorky
• Jednoduché nastavování a minimalizace mrtvého času MS
• Spolehlivá kvantifikace TMT a label-free přístupy

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s umělou inteligencí pro automatickou optimalizaci metod
• Další rozvoj mikro- a nanoflow automatizace
• Propojování s celulárními a metabolomickými workflowy pro multi-omics přístupy
• Využití v klinické a průmyslové QA/QC laboratoři pro vysokoprocesní rutinní analýzy

Závěr

Tandem direct injection workflow na Vanquish Neo UHPLC v kombinaci s dvojitým nanoion source a Orbitrap Exploris/Astral MS výrazně zvyšuje využití spektrometru, propustnost a citlivost LC-MS analýz, přičemž si zachovává jednoduchost ovládání a minimální carryover. Díky podpoře širokého spektra kolony a flexibilním parametrům představuje univerzální řešení pro moderní proteomické aplikace.

Reference

1. Zheng R. et al. J. Proteome Res. 2022, 21(10), 2545–2551.
2. Stewart H. et al. Anal. Chem. 2023, 95(42), 15656–15664.
3. Sonation GmbH. Double barrel oven pro NanoSpray Flex ES071/ES072, 2024.
4. Pynn C. et al. Thermo Fisher Scientific Technical Note 72899, 2019.
5. Zheng R. et al. Technical Note 73671, 2020.
6. Thermo Fisher Vanquish Neo User Guide 2.0, 2024.
7. Zheng R. et al. Technical Note 000138, 2021.
8. Zheng R. et al. Anal. Chem. 2023, 95(51), 18673–18678.
9. Budnik B. et al. Genome Biol. 2018, 19, 161.