Quantification of total homocysteine in human plasma or serum by liquid chromatography-tandem mass spectrometry for use in clinical research

Význam tématu

Monitoring celkové homocysteinu v plasmě či séru je klíčový pro hodnocení funkce methioninového cyklu, jehož poruchy se spojují s kardiovaskulárními chorobami, neurodegenerativními stavy i metabolickými poruchami. Přesné stanovení hladiny homocysteinu pomáhá sledovat nutriční a genetické faktory ovlivňující tento centrální biochemický okruh.

Cíle a přehled studie

Studie popisuje validaci rychlé a citlivé LC MS MS metody na platformě Thermo Scientific Transcend II spojené s TSQ Quantis triple quadrupole hmotovým spektrometrem. Cílem je spolehlivě kvantifikovat celkový homocystein po redukci všech disulfidických forem na volnou formu a dosáhnout laboratorních standardů přesnosti, linearity a reproducibility.

Použitá metodika a instrumentace

Postup přípravy vzorku zahrnuje:

• Odběr 50 µL plazmy či séra a přidání 50 µL redukčního činidla a 50 µL interního standardu d8 homocystinu
• Inkubační doba 5 minut při pokojové teplotě
• Proteinová precipitace přidáním 200 µL precipitantu, vortex, inkubace 5 minut při 4 °C a centrifugace 10 000 x g po dobu 5 minut
• Transfer supernatantu do autosampleru

Chromatografie probíhá izokraticky při průtoku 0,55 mL/min, doba analýzy 1,2 min, objem injekce 5 µL. Hmotová spektrometrie využívá HESI v pozitivním módu a vyhledávání dvou SRM přechodů pro analyzát i interní standard. Parametry MS jsou optimalizovány pro maximální citlivost a selektivitu.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda vykazuje lineární odpověď v rozmezí 0,794 až 6,86 ng/mL s hodnotou R2 nad 0,999. Nebyl zjištěn významný carryover. Finanční bias mezi nominální a zpětně spočítanou koncentrací kontrolních vzorků se pohyboval mezi -2,2 a -1,7 procenty. Intraassay přesnost vyjádřená CV byla vždy pod 2,1 procenta, interassay CV nepřekročila 2,0 procenta. Výsledky potvrzují vysokou opakovatelnost a spolehlivost metody.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Minimální objem vzorku a rychlou přípravu bez složitých kroků derivatizace
• Vysokou propustnost díky krátké době analýzy
• Vhodnost pro klinické výzkumné projekty a nutriční metabolomiku
• Možnost zahrnout do sledování homocysteinu i interní standard pro robustní kvantifikaci

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozšíření metody může zahrnovat multiplexní stanovení dalších metabolitů a ko faktorů methioninového cyklu v rámci nutričního fenotypování. Automati zace přípravy a integrace do vysoce propustných platforem umožní personalizované sledování stavu homocysteinu v populačních studiích a klinických zkouškách.

Závěr

Popsaná LC MS MS metoda na platformě Transcend II a TSQ Quantis umožňuje rychlou, přesnou a reprodukovatelnou kvantifikaci celkového homocysteinu v lidské plasmě a séru. Splňuje požadavky výzkumných laboratoří na citlivost, linearitu, přesnost a opakovatelnost.

Reference

• De Nardi C , Brambilla P , Brambilla M , Fania C Quantification of total homocysteine in human plasma or serum by liquid chromatography tandem mass spectrometry for use in clinical research Technical Note No 73268 Thermo Fisher Scientific 2019