Quantification of total homocysteine in human plasma or serum by LC-HRAM-MS for clinical research

Význam tématu

Homocystein je klíčovým biomarkerem methioninového cyklu, jehož narušení je spojováno s rizikem kardiovaskulárních onemocnění, kognitivního úpadku a neurodegenerativních poruch. Přesná detekce a kvantifikace celkového homocysteinu v plazmě nebo séru umožňuje hlubší porozumění interakcím mezi výživou, genetikou a fyziologií, což je zásadní pro klinický výzkum i nutriční metabolomiku.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo navrhnout a validovat LC-HRAM-MS metodu pro spolehlivé stanovení celkového homocysteinu v lidské plazmě a séru s využitím:

• Q Exactive Plus hybridního kvadrupól-Orbitrap hmotnostního spektrometru
• Vanquish Duo UHPLC systému
• offline přípravy vzorku pomocí ClinMass Complete Kit Homocysteine

Metoda je optimalizovaná pro klinický výzkum a nutriční analýzy, kde je vyžadována vysoká selektivita a citlivost.

Použitá metodika

Vzorek plazmy nebo séra (50 µl) byl smíchán s redukčním roztokem a interním standardem (d8-homocystin redukovaný na d4-homocystein) a inkubován 5 minut při laboratorní teplotě. Následovala precipitace bílkovin přidáním 200 µl srážecího činidla, vortex, 5min inkubace při 4 °C a centrifugace na 10 000 × g. Supernatant se přenesl k injekci.
Chromatografie probíhala isokraticky na analytickém sloupci při průtoku 0,7 ml/min, teplotě 25 °C a celkovém runtime 1,0 minuty, injekční objem byl 5 µl.
Detekce pomocí Parallel Reaction Monitoring (PRM) s rozlišením 17 500 (m/z 200), normalizovaným kolizním energiím 20, 30 a 40 a AGC target 1e6.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific Vanquish Duo UHPLC s binárními Vanquish Flex pumpami
• Thermo Scientific Q Exactive Plus hybridní kvadrupól-Orbitrap MS
• HESI-II zdroj v pozitivním ionizačním režimu
• Software TraceFinder 5.1 pro akvizici a kvantifikaci dat
• ClinMass Complete Kit Homocysteine in Plasma/Serum od RECIPE

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala lineární odezvu v rozsahu 0,419 ng/ml (LLOQ) až 6,85 µg/ml s biasem nom./zpětně vypočtené koncentrace ±15 % (±20 % pro nejnižší koncentraci). Nebyl pozorován žádný carryover. Přesnost (bias) u interních a externích kontrol (RECIPE, NIST SRM 1950) byla mezi 4,1 a 5,3 %. Intra- a inter-assay preciznost dosáhla maximálně 2,6 %, resp. 2,5 % CV.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Vysokou selektivitu a citlivost díky HRAM-MS
• Rychlý analytický běh (1 minuta na vzorek)
• Robustní přípravu vzorku se standardizovaným kit
• Vhodnost pro klinický výzkum, nutrikinetiku a nutriční metabolomiku

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření metody o online SPE a multiplexní analýzu dalších biomarkerů methioninového cyklu, integrace s dalšími omickými platformami, vývoj real-time monitoringu homocysteinu u pacientů a populací s různými nutričními a genetickými profily.

Závěr

Popsaná LC-HRAM-MS metoda poskytuje rychlou, přesnou a reprodukovatelnou kvantifikaci celkového homocysteinu v lidské plazmě a séru. Vysoká přesnost, linearita a nízké CV ji činí vhodnou pro výzkum i klinické aplikace s nároky na citlivost a selektivitu.

Reference

1. De Nardi C, Kern K, Berger S. Quantification of total homocysteine in human plasma or serum by LC-HRAM-MS for clinical research. Thermo Fisher Scientific Technical Note TN66048-EN, 2021.