Robust, reliable assay to quantify total homocysteine in human plasma or serum by liquid chromatographytandem mass spectrometry for use in clinical research

Význam tématu

Monitoring celkové hladiny homocysteinu v lidském plazmatu je klíčový pro hodnocení funkce methioninového cyklu, jenž ovlivňuje cardiovasculární zdraví, kognitivní výkonnost i riziko neurodegenerativních onemocnění. Díky spolehlivému stanovení homocysteinu lze sledovat vliv výživy, genetických a environmentálních faktorů na metabolismus a podporovat personalizovaný přístup v klinickém výzkumu.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo vyvinout a validovat citlivou, přesnou a reprodukovatelnou LC-MS/MS metodu pro kvantifikaci celkového homocysteinu v lidské plazmě či séru za použití Thermo Scientific TSQ Quantis triple-stage kvadrupolového hmotnostního spektrometru. Metoda zahrnuje redukci všech forem homocysteinu na jeho volnou formu, jednoduchou přípravu vzorku a rychlou chromatografii s celkovou dobou analýzy 3,5 minuty.

Použitá metodika

Vzorky plazmy (50 µl) byly smíchány s vnitřním standardem (d8-homocystin) a redukčním činidlem (DTT), inkubovány při 35 °C 15 minut, následovalo vysrážení proteinů metanolem, chlazení a odstředění. Supernatant se vstřikoval do UHPLC systému; kolona Acclaim PolarAdvantage II (100×3,0 mm, 3 µm) pracovala s gradientem vody a methanolu s 0,1 % kyseliny mravenčí. Detekce probíhala SRM režimem na TSQ Quantis se dvěma přechody pro analyt a interní standard.

Použitá instrumentace

• UHPLC Thermo Scientific Transcend II
• Kolona Acclaim PolarAdvantage II 100×3,0 mm, 3 µm
• MS Thermo Scientific TSQ Quantis triple-stage kvadrupol s HESI v pozitivním režimu
• Software TraceFinder 4.1 pro akvizici a vyhodnocení dat

Hlavní výsledky a diskuse

Kalibrace byla lineární v rozsahu 0,794–6,86 ng/ml s R2 > 0,999. Mez kvantifikace pokrývá klinicky relevantní hladiny. Nulový carry-over prokázal čistotu metody. Přesnost (bias −0,3 %) a precize (intra- i inter-denní CV ≤ 3,3 %) splňovaly standardy klinického výzkumu. Rychlost analýzy a robustnost ukazují vysokou vhodnost pro pracoviště s vysokým objemem vzorků.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje spolehlivé měření celkového homocysteinu s minimální spotřebou vzorku a krátkým časem analýzy. Vhodná je pro studia výživy, kardiometabolických onemocnění a farmakokinetické studie doplňků či léčiv ovlivňujících methioninový cyklus.

Budoucí trendy a možnosti využití

Vývoj zahrnuje rozšíření panelu biomarkerů methionin-homocysteinového cyklu, automatizaci přípravy vzorků a integraci s vysokoobjemovými platformami. Kombinace s multi-omics přístupy přinese komplexnější obraz metabolických sítí a podpoří precizní medicínu.

Závěr

Popsaná LC-MS/MS metoda poskytuje rychlé, přesné a reprodukovatelné stanovení celkového homocysteinu v plazmě. Splňuje požadavky klinického výzkumu a otevírá prostor pro další aplikace v nutrimetabolomice a personalizované diagnostice.