Online 2D-nanoLC hyphenated with high-resolution accurate-mass Orbitrap mass spectrometry for comprehensive and robust proteome profiling

Význam tématu

Hloubková proteomika umožňuje detailní charakterizaci složitých biologických vzorků, avšak offline frakcionace je časově náročná a náchylná ke ztrátám vzorků. Adaptace online dvoudimenzionální nanoLC MS zvyšuje rychlost, reprodukovatelnost a hloubku pokrytí proteomu, což je klíčové pro výzkum buněčných kultur i biologických tekutin.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout jednoduchou a plně automatizovanou platformu online 2D nanoLC MS, kombinující vysokopH a nízkopH reverzní fázi na jednom stanovišti s masovým spektrometrem Orbitrap Exploris 480. Metoda byla ověřena na komerčním HeLa digestu a přímém lidském séru bez předchozího deplečního kroku.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorků byl HeLa digest nakonzervován v 0,1 % kyselině mravenčí a sérum bylo zpracováno metanolovou precipitací, dvojitou trypsinací a SPE C18 čisticí kartáčkou.

• UltiMate 3000 RSLCnano moduly NCS 3500RS, NCP 3200RS, WPS 3000TPL RS, VWD 3400RS
• 10portový dvoupolohový ventil v komorě sloupců
• První dimenze monolitický PepSwift 100 µm x 250 mm, druhá dimenze analytický EASY Spray 75 µm x150 mm
• Dva nano trapovací C18 sloupce pro střídavou akumulaci frakcí
• Orbitrap Exploris 480 v režimu DDA
• Mobilní fáze vysokopH buffer 50 mM NH4HCO3, nízkopH 0,1 % formová a 0,2 % trifluoroctová kyselina

Hlavní výsledky a diskuse

Byly optimalizovány 2, 4 a 8 frakční metody. S 8 frakcemi z HeLa digestu za 6,75 h bylo identifikováno téměř 7000 proteinových skupin a více než 70 000 peptidových skupin. Při zpětném zpracování v Proteome Discoverer 2.4 a využití spektrální knihovny se počet zvýšil na přibližně 7750 proteinů a 88 000 peptidů. U lidského séra s 4 frakcemi bylo dosaženo průměrně 329 proteinů a 3700 peptidů za 3,75 h. Peptidové frakce vykazují dobrou ortogonalitu a vysoké využití spektrometru přes 80 %, přičemž opakovatelnost analýzy napříč 15 vzorky je vysoká.

Přínosy a praktické využití metody

• Minimální manuální manipulace se vzorkem po enzymatické digesti
• Automatizace a vysoká propustnost analýz bez offline kroků
• Vysoká hloubka proteomického pokrytí u buněčných a klinických vzorků
• Doplněk k jednorozměrným separacím s lepší kompatibilitou nanoLC
• Rychlá adaptace pro různá typová spektra vzorků a různé počty frakcí

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozšíření metody směřuje k vyššímu počtu frakcí, kratším gradientům a užším kapilárám pro single cell proteomiku. Dále se očekává hlubší integrace s knihovnami spektrálních dat a pokročilými vyhledávacími algoritmy, což zvýší analytickou citlivost i průchodnost.

Závěr

Popsaná online 2D nanoLC MS platforma nabízí flexibilní, citlivé a vysoce reprodukovatelné řešení pro hluboké proteomické charakterizace buněčných a tělních tekutin. Díky plné automatizaci, vysokému využití spektrometru a snadné škálovatelnosti představuje efektivní alternativu k nepříznivým offline metodám.

Reference

1. Boychenko A et al Tailored high throughput low flow LC MS methods for large scale sample cohort analysis Thermo Scientific Technical Note 73208
2. Osorio D et al Peptides Calculate indices and theoretical physicochemical properties of peptides and protein sequences R package Version 2.2
3. R Core Team R A language and environment for statistical computing R Foundation for Statistical Computing Vienna Austria 2019
4. Carr D et al Hexagonal Binning Routines GitHub 2019