Sensitive and High-throughput Single-cell Proteomics Workflow on New Quadrupole-ion trap-Orbitrap Mass Spectrometer with FAIMS Separation

Význam tématu

Výzkum proteomu na úrovni jediné buňky umožňuje odhalit buněčnou heterogenitu a biologické procesy, které jsou skryté při analýze větších populací. Tradiční LC-MS přístupy selhávají pro ultramalé vzorky kvůli ztrátám při přípravě, nízké citlivosti a omezené propustnosti. Integrace nanoPOTS a FAIMS s Orbitrap Eclipse MS představuje průlom v ultra citlivé a vysoce výkonné single-cell proteomice.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyvinout workflow pro analýzu proteomu jednotlivých savčích buněk použitím:

• nanoPOTS pro efektivní přípravu stopových vzorků
• FAIMS Pro Interface pro odstranění chemického šumu a zvýšení citlivosti
• TMT multiplexního značení pro kvantifikaci více buněk v jednom běhu
• Orbitrap Eclipse Tribrid s Real-Time Search pro spolehlivou identifikaci a kvantifikaci

Použitá metodika a instrumentace

• Izolace buněk pomocí FACS a příprava na nanoPOTS čipu
• Štěpení enzymem trypsin, TMT multiplexní značení pro trojici myších buněčných typů
• Ultra-nízký nanoLC průtok (20 nL/min) na UltiMate 3000 RSLCnano se SPE trapem a analytickou kolonkou (20 nebo 30 µm i.d.)
• Thermo Scientific Orbitrap Eclipse Tribrid s FAIMS Pro Interface, CV přepínání pro label-free, Real-Time Search pro SPS MS3
• Software: Proteome Discoverer 2.4 (SEQUEST, Percolator), MaxQuant (Match between runs)

Hlavní výsledky a diskuse

• Label-free workflow: průměrná identifikace 829 proteinových skupin z jedné HeLa buňky, trojnásobné zvýšení oproti bez FAIMS.
• Optimalizace metodiky vedla k detekci až 2023 proteinů a 8571 peptidů z 0,5 ng HeLa digestu (2 hodiny gradient, dvě CV).
• TMT multiplexní analýza trojice myších buněk: 2346 proteinů a 4781 peptidů, lepší kvantitativní přesnost a rozlišení buněčných typů při SPS MS3 Real-Time Search.
• PCA analýza jednočlánkové úrovně ukázala jasné odlišení epitelových, endotelových a imunitních buněk.

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost analýzy vzácných buněk, například cirkulujících nádorových buněk.
• Vysoká kvantitativní přesnost při zachování rozsahu proteomu.
• Široké uplatnění v základním výzkumu, QA/QC, klinickém výzkumu a průmyslové analytice.

Budoucí trendy a možnosti využití

Vývoj bude směřovat k dalšímu zvýšení propustnosti a citlivosti, integraci s dalšími omickými technologiemi a automatizaci nanoPOTS platformy. Rozšíření multiplexního značení, pokročilé metody iontové mobility a kombinace s prostorovou proteomikou nabídnou nové možnosti pro detailní analýzu tkáňové heterogenity a dynamiky buněčných populací.

Závěr

Představený workflow kombinuje nanoPOTS, FAIMS Pro a Orbitrap Eclipse Tribrid s Real-Time Search a TMT značením, čímž poskytuje bezprecedentní citlivost a výkonnost v single-cell proteomice. Tento přístup otevírá cestu k hlubší exploraci buněčné heterogenity a aplikacím v klinickém a biotechnologickém výzkumu.

Reference

1. Zhu Y., et al. Angew. Chemie Int. Ed. 57, 12370 (2018)
2. Zhu Y., et al. Nat. Commun. 9, 882 (2018)
3. Budnik B., et al. Genome Biol. 19, 161 (2018)