Thermo Scientific Orbitrap Eclipse Tribrid mass spectrometer

Význam tématu

Vývoj hmotnostního spektrometru Orbitrap Eclipse Tribrid představuje zásadní pokrok v schopnosti analyzovat složité biologické i farmaceutické vzorky. Díky kombinaci inovativní Tribrid architektury, rozšířeného m/z rozsahu a inteligentního řízení sběru dat v reálném čase nabízí nástroj nevídanou citlivost, selektivitu a univerzálnost. To umožňuje hlubokou charakterizaci proteomů jednotlivých buněk, biologických komplexů i terapeutických proteinů s vysokou přesností a reprodukovatelností.

Cíle a přehled studie / článku

Článek popisuje konstrukční vylepšení a aplikační možnosti Orbitrap Eclipse Tribrid MS: 1) rozšířené iontové vedení a filtraci, 2) aktivní Ion Beam Guide, 3) zdokonalené řídicí protokoly v reálném čase (Real-Time Search), 4) kombinaci více disociačních metod (CID, HCD, ETD, EThcD, UVPD) v jednom přístroji. Demonstrace přístroje zahrnuje single-cell proteomiku, vysokopropustné kvantitativní srovnání pomocí TMTpro 16plex, nativní analýzu terapeutických proteinů včetně komplexů s ligandy, a top-down charakterizaci proteoformů s použitím PTCR.

Použitá instrumentace

• Orbitrap Eclipse Tribrid MS s ultra-vysokým polem Orbitrap analyzátorem (>500 000 FWHM, až 40 Hz MSn)
• Segmentovaný kvadrupól s Hyperbolickými povrchy pro izolaci s šířkou 0,4 m/z
• EASY-IC/ETD/PTCR zdroj založený na Townsendově výboji
• Electrodynamic Ion Funnel a High-Capacity Transfer Tube (HCTT) pro zvýšený iontový tok
• Ion-Routing Multipole a duální tlaková lineární iontová past pro MSn disociace
• Volitelné moduly: EASY-ETD, PTCR, HMRn (do m/z 8 000), FAIMS Pro, UVPD, EASY-IC, 1 M interní kalibrace

Použitá metodika

Real-Time Search propečuje on-the-fly rozpoznání peptidových spekter a cílené MS3 akvizice fragmentů nesoucích TMT značky, čímž se minimalizuje rušivý signál a maximalizuje kvantitativní přesnost. Single-cell workflow kombinuje FACS separaci buněk, tryptickou digest, TMTpro značení až 16 kanálů a MS3 sběr s Real-Time Search. Nativní analýza terapeutických proteinů zahrnuje ESI pod podmínkami zachování struktury, PTCR pro snížení nabití a HMRn pro rozšířenou detekci vysoce m/z iontů. Top-down approach s PTCR redukuje složitost spekter a zvyšuje počet charakterizovaných proteoformů.

Hlavní výsledky a diskuse

• Single-cell proteomika: detekováno přes 300 diferencovaně exprimovaných proteinů v jednotlivých buňkách; PCA ukázala jasné rozlišení tří typů buněk.
• Vysokopropustná kvantifikace: Real-Time Search zvýšila počet kvantifikovaných peptidů o ~38 % a bílkovin o ~53 % oproti klasickému SPS MS3, přičemž doba analýzy se zkrátila o polovinu.
• Nativní charakterizace proteoformů: PTCR odhalilo více než 30 glykoproteoform cytokinového Fc-fusního proteinu; MS2 (HCD, ETD, EThcD, UVPD) pokrylo 100 % CDR3 oblastí trastuzumabu.
• Identifikace ligandů v membránových proteinech pomocí top-down MSn: pseudo MS2 uvolnil ligand, MS4 spektrum umožnilo jednoznačnou identifikaci ampicilinu v komplexu s OmpF.
• PTCR v top-down experimentech: u rozsahových proteinů (>25 kDa) se počet rozlišených a charakterizovaných proteoformů zvýšil z desítek na stovky.

Přínosy a praktické využití metody

Orbitrap Eclipse Tribrid MS přináší nejvyšší citlivost pro ultra-nízke vzorky (single-cell), umožňuje hlubokou proteomickou charakterizaci ve vysokém multiplexu (TMTpro 16plex) a detailní studium proteoformů i nativních komplexů v jednom přístroji. To nachází uplatnění v biomedicínském výzkumu, vývoji biologických léčiv, QC v bioprodukci a strukturální biologii.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace pokročilých modulů (FAIMS Pro, UVPD) pro další zvýšení selektivity a sekvenční hloubky.
• Rozvoj aplikací pro glykoproteomiku a komplexní lipidomiku pod nativními podmínkami.
• Automatizace metodiky Real-Time Search s umělou inteligencí pro adaptivní rozhodování o disociaci v rámci jednoho běhu.
• Široké nasazení v klinické proteomice, personalizované medicíně a výzkumu heterogenity nádorových buněk.

Závěr

Orbitrap Eclipse Tribrid MS představuje všestranné řešení pro náročné analytické úlohy v moderní proteomice a biochemii. Kombinace vysoce přesné Orbitrap detekce, inteligentního sběru dat a modulární architektury umožňuje bezprecedentně detailní a rychlé charakterizace biologických vzorků od jednotlivých buněk až po komplexní proteoformní analýzu.

Reference

• Budnik et al., Genome Biology, 2018, 19(1)
• Zhu et al., Nature Communications, 2018, 9(882)
• Ting et al., Nature Methods, 2011, 8(11)
• Gault et al., Nature Methods, in press
• Huguet et al., Analytical Chemistry, 2019, 91(24)
• Fornelli et al., Journal of Proteome Research, (rok)