Ultra Sensitive LC-MS Workflow for Single Cell Proteomic Analysis

Význam tématu

Analýza proteomu na úrovni jediné buňky představuje významný milník v biologických a klinických výzkumech. Umožňuje odhalit heterogenitu buněčných populací, identifikovat vzácné či patologické buňky a studovat odpověď jednotlivých buněk na podněty či léčiva. Moderní workflow kombinuje miniaturizovanou přípravu vzorku, ultra citlivou chromatografii s nízkými průtoky a vysoce výkonnou hmotnostní spektrometrii, čímž dosahuje hlubokého proteomického pokrytí i z velmi omezeného materiálu.

Cíle a přehled studie

Prezentovaný whitepaper popisuje kompletní ultra citlivé LC–MS workflow pro proteomickou analýzu jednotlivých buněk. Hlavní cíle studie jsou:

• Vyvinout a optimalizovat nanolitrovou přípravu vzorku (nanoPOTS) pro zpracování jedné buňky.
• Implementovat nízkoprůtokovou nanochromatografie na kolonkách s integrovaným emiterem.
• Vyhodnotit výkonnost nových hmotnostních analyzátorů Orbitrap Eclipse Tribrid MS a Exploris 480 MS s volitelným FAIMS Pro rozhraním.
• Prokázat přínos Real-Time Search a TMT multiplexního značení při kvantitativní analýze jednotlivých buněk.

Použitá metodika a instrumentace

Příprava vzorku:

• Izolace buněk pomocí FACS (fluorescenční aktivovaný sortér buněk).
• NanoPOTS platforma: nanodroplet Processing in One-pot for Trace Sample – extrac­ce, redukce, alkylace a enzymatická štěpení (Lys-C/Trypsin) v nanolitrech.
• Multiplexní značení TMT (10plex, TMTpro 16plex) s boost kanálem pro zvýšení signálu.

Separace:

• Thermo Scientific UltiMate 3000 RSLCnano systém s nízkoprůtokovým splitterem (20–25 nl/min).
• Kolony s vnitřním průměrem 20–30 µm a integrovaným emitorem o délce 30 cm (CoAnn Tech).

Detekce a akvizice:

• Orbitrap Eclipse Tribrid MS s kvadrupólem QR5, real-time search, HMRn a PTCR.
• Orbitrap Exploris 480 MS s FAIMS Pro rozhraním (CV stepping).
• Dissociační metody: HCD, CID, ETD, EThcD, UVPD.
• Software: Comet search enginе pro real-time search, Proteome Discoverer 2.4, MaxQuant.

Hlavní výsledky a diskuse

Label-free analýza jednotlivých HeLa buněk na Orbitrap Eclipse Tribrid MS přinesla identifikaci ~450 proteinových skupin (<1% FDR). Při použití FAIMS Pro bylo za 120 min gradientu z 200 ng HeLa digestu identifikováno průměrně 6200 proteinů bez FAIMS a 7800 s FAIMS (+25 %). Orbitrap Exploris 480 MS v kombinaci s FAIMS dosáhl podobné citlivosti a reproducibility (<2 % CV).
Implementace Real-Time Search výrazně zvětšila proteomové pokrytí i rychlost SPS MS3 TMT analýzy, kdy bylo možné za poloviční čas kvantifikovat stejný počet peptidů jako u klasické SPS MS3. Tímto přístupem bylo v jedné injekci z 0,5 ng HeLa digestu dosaženo ~750 proteinů z jediné buňky a ~2346 proteinů po optimalizaci.
Klasifikace tří buněčných linií (epitelové, endotelové a imunitní) pomocí MS2 i SPS MS3 s real-time search prokázala rozlišení typů a detekci biomarkerů (CD14, PTEN, eIF4B). Pilotní aplikace TMTpro 16plex umožnila analýzu až 14 buněk v jedné LC–MS run.

Přínosy a praktické využití metody

Workflow umožňuje:

• Analýzu vzácných buněk (CTC, biopsie, exozomy) bez ztráty proteomové informace.
• Detekci heterogenity v nádorových a imunitních populacích.
• Vysoce přesné kvantitativní srovnání buňka-buňka s minimálními artefakty chromatografie.
• Škálovatelnost pro multiplexní screening a klinické studie.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje:

• Integrace single-cell proteomiky s dalšími „omics“ (transkriptomika, metabolomika).
• Rozšíření multiplexního značení (TMTpro, nové izobarické tagy) pro vyšší propustnost.
• Automatizace a miniaturizace platformy nanoPOTS pro automatické zpracování stovek buněk.
• Využití umělé inteligence ve vyhodnocení heterogenních vzorků a identifikaci nových biomarkerů.

Závěr

Prezentovaný ultra citlivý LC–MS workflow spojuje inovativní přípravu vzorku nanoPOTS, nízkoprůtokovou nanochromatografii, pokročilou orbitrapovou hmotnostní spektrometrii, FAIMS Pro a Real-Time Search pro dosažení hluboké a přesné proteomické analýzy jednotlivých buněk. Metoda poskytuje nástroj pro výzkum buněčné heterogenity, rychlou kvantifikaci a potenciál pro klinické a průmyslové aplikace.

Reference

• Zhu Y. et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2018, 57, 12370–12374.
• Pfammatter S. et al., Mol. Cell. Proteomics, 2018, 17, 1864–1876.
• Budnik B. et al., Genome Biol., 2018, 19, 161.
• Eng J.K., Jahan T.A., Hoopmann M.R., Proteomics, 2013, 13(1), 22–24.
• J. Proteome Res., 2019, 18(3), 1299–1306.