High-throughput single-cell proteomics analysis with nanodroplet sample processing, multiplex TMT labeling, and ultra-sensitive LC-MS

Význam tématu

Analýza proteomu na úrovni jednotlivé buňky umožňuje odhalit buněčnou heterogenitu v biologických souborech, identifikovat vzácné subpopulace a pochopit molekulární mechanismy vývoje či onemocnění. Tradiční přístupy jsou často limitovány nízkou výtěžností přípravy vzorků a malým objemem proteinu, což omezuje citlivost a průtok analýzy.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout vysoce výkonnou metodiku pro kvantitativní proteomiku jednotlivých buněk. Autoři kombinovali nanodropletovou platformu nanoPOTS s isobarickým značením TMT10plex a ultra citlivou LC-MS analýzou na Orbitrap Eclipse Tribrid hmotovém spektrometru se systémem Real-Time Search, aby zvýšili pokrytí proteomu a přesnost kvantifikace při vysoké propustnosti.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky:

• Jednotlivé myší buňky (epiteliální, endoteliální, imunitní) izolované pomocí fluorescenčně aktivované třídicí analýzy (FACS).
• Boost vzorek o hmotnosti 5 ng pro zvýšení signálu.

Postup přípravy:

• NanoPOTS platforma pro enzymatickou štěpení a značení ve velmi malém objemu (200 nL) s TMT10plex isobarickými značkami.
• Snížení, alkylace a tryptické štěpení v jednom kyvetovém systému minimalizující ztráty.

Chromatografie a hmotová spektrometrie:

• Thermo Scientific UltiMate 3000 RSLCnano se 30 cm C18 kolonkou (30 µm i.d.) s integrovaným nanoespray emitorem.
• Orbitrap Eclipse Tribrid MS s metodami MS2 a SPS MS3 s Real-Time Search (RTS) pro selektivní spouštění MS3 skenů.

Software:

• Proteome Discoverer 2.4 pro identifikaci a kvantifikaci proteinů.

Hlavní výsledky a diskuse

Pomocí TMT10plex MS2 přístupu bylo identifikováno 1676 proteinů a kvantifikováno 823 proteinů ve 24 buněčných analýzách, umožňujících rozlišení tří myších buněčných typů (PCA a heatmapy). Díky SPS MS3 s Real-Time Search se počet identifikovaných proteinů zvýšil na 2346 a kvantifikovaných na 1300 v 16 buňkách, přičemž se výrazně zlepšila kvantifikační přesnost a pokrytí diferenciálně exprimovaných markerů. Volcano analýzy potvrdily zvýšenou citlivost a reprodukovatelnost při detekci biomarkerů pro jednotlivé buňky.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje:

• Vysokopropustné kvantitativní studie jednotlivých buněk s cílem pochopit buněčnou heterogenitu.
• Detekci a kvantifikaci více než 2000 proteinů z jednotlivých buněk.
• Analýzu vzácných buněčných subpopulací či cílených klinických vzorků (např. cirkulující nádorové buňky).

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření metod pro proteomové mapování tkáňové heterogenity za využití imuno-histochemie nebo laserové mikrodissekce ve spojení s nanoPOTS a TMT značením. Pokroky v automatizaci a dalším zmenšování objemů vzorků mohou posunout hranici citlivosti směrem k analýze subkompartimentálních částí buněk či exozómů. Integrace strojového učení a real-time datových analýz umožní rychlejší a cílenější volbu datově bohatých fragmentů.

Závěr

Kombinace nanoPOTS se značkováním TMT a ultra citlivou Orbitrap Eclipse Tribrid LC-MS platformou s Real-Time Search přináší robustní workflow pro vysokopropustnou proteomiku jednotlivých buněk. Metoda dosahuje vysokého proteomového pokrytí, přesné kvantifikace a otvírá cestu k rozsáhlým studiím buněčné heterogenity a klinických vzorků.

Reference

1. Zhu Y. et al. 2018. Nanodroplet Processing in One Pot for Trace Samples (nanoPOTS). Angewandte Chemie International Edition, 57:12370–12374.
2. Budnik B. et al. 2018. SCoPE-MS: single-cell proteomics by mass spectrometry. Genome Biology, 19:161.
3. Erickson B.K. et al. 2019. Real-Time Search for High-Accuracy Quantification with SPS-MS3. Journal of Proteome Research, 18:1299–1306.