SureQuant Targeted Mass Spectrometry Standards and Assay Panel for Quantitative Analysis of Phosphorylated Proteins from Multiple Signaling Pathways

Význam tématu

Analýza fosforylace proteinů je klíčová pro pochopení regulačních mechanismů buněčné signalizace, které ovlivňují normální růst, diferenciaci i patologické stavy, například nádorovou transformaci. Cílená kvantifikace změn fosforylačního stavu umožňuje monitorovat aktivitu signálních drah a hodnotit účinnost terapeutických zásahů.

Cíle a přehled studie / článku

Studie si kladla za cíl ověřit a porovnat nové komerční standardy Thermo Scientific™ SureQuant™ pro cílenou analýzu fosfoproteomiky: multipathway phosphopeptide standard a phosphopeptide suitability standard. Autoři demonstrovali jejich využití pro hodnocení výkonnosti LC-MS/MS systému a kvantifikaci fosforylačních událostí napříč hlavními signálními drahami.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorků byly kultivovány různé buněčné linie (MCF7, HCT116, A431, LNCAP, HepG2) s různými stimuly (hIGF-1, hEGF). Proteiny byly štěpeny pomocí Thermo Scientific™ EasyPep™ kitu a obohaceny o těžce značené multipathway standardy před nebo po obohacení fosfopeptidů.
Pro obohacení byly porovnány tyto přístupy:

• Hi-Select™ Fe-NTA magnetická agaróza
• SMOAC (Sequential Metal Oxide Affinity Chromatography)
• konkurenční Fe-NTA

Rozdělení a destrukce vzorků proběhly na Dionex UltiMate 3000 RSLCnano nebo EASY-nLC 1200 systémech s kolonkami Acclaim PepMap a EASY-Spray C18. Spektra byla získána na Orbitrap Q Exactive HF a Orbitrap Exploris 480. Cílená akvizice využívala režim SureQuant IS-triggered a PRM/DDA.

Hlavní výsledky a diskuse

Implementace phosphopeptide suitability standardu umožnila komplexní kontrolu výkonnosti LC-MS/MS před analýzou vzorků. Multipathway standardy detekovaly až 131 fosforylačních událostí. Nová metoda obohacení na Hi-Select Fe-NTA prokázala vyšší citlivost a detekční limity než SMOAC či konkurenční metody. SureQuant IS-triggered cílená akvizice překonala běžné PRM i DDA acquisice, zejména u nízce abundantních signálních proteinů.

Přínosy a praktické využití metody

• Standardizovaná kontrola kvality LC-MS/MS (suitability standard) pro rutinní i výzkumné laboratoře
• Multiplexní kvantifikace biologicky relevantních fosforylačních míst napříč několika drahami
• Vyšší citlivost, přesnost a specifita díky IS-triggered akvizici
• Modulární workflow vhodné pro screening farmakologických modulátorů signálních drah

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření strategie SureQuant na další typy post-translačních modifikací, integrace s automatizovanými přípravami vzorků a využití strojového učení pro pokročilou analýzu dat. Metoda může být adaptována pro klinické aplikace, pacientské vzorky a multiomické studie.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific™ Dionex™ UltiMate™ 3000 RSLCnano
• Thermo Scientific™ EASY-nLC™ 1200
• Orbitrap Q Exactive™ HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap MS
• Orbitrap Exploris 480 MS
• Hi-Select™ Fe-NTA Magnetic Agarose, SMOAC
• Acclaim™ PepMap RSLC C18 a EASY-Spray™ C18 kolony

Závěr

Nové Thermo Scientific™ SureQuant™ standardy v kombinaci s optimalizovaným obohacením fosfopeptidů a IS-triggered akvizicí představují účinný a citlivý přístup pro cílenou kvantifikaci fosforylačních změn v signálních drahách. Metoda nabízí robustní QC, vysokou přesnost a široké možnosti aplikace ve výzkumu i průmyslu.