SureQuant Targeted Mass Spectrometry Standards and Assay Panel for Quantitative Analysis of Phosphorylated Proteins from Multiple Signaling Pathways

Význam tématu

Proteinová fosforylace hraje klíčovou roli v regulaci buněčných signalizačních drah, ovlivňuje růst, diferenciaci a apoptózu. Porozumění dynamice fosforylačních změn je zásadní pro studium normální buněčné funkce i patologických stavů, například rakoviny, kde dochází k deregulaci signálů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo představit a vyhodnotit standardy SureQuant pro cílenou hmotnostní spektrometrii fosfopeptidů: multipathway standard (PN# A51745) a systémový vhodnostní standard (PN# A51746). Studie hodnotí jejich využitelnost pro kvalifikaci LC-MS/MS systému a kvantitativní analýzu fosforylovaných proteinů z více signalizačních drah.

Použitá metodika a instrumentace

• Cell culture a příprava vzorků: buněčné linie MCF7, HCT116, A431, LNCAP a HepG2 stimulované IGF-1 či EGF; lyze pomocí EasyPep kitu s inhibitorem fosfatázy.
• Obohacení fosfopeptidů: porovnání metod Hi-Select Fe-NTA magnetické agarozy, sekvenční metal-oxidové affinitní chromatografie (SMOAC) a Ti-IMAC.
• Instrumentace: nanoLC systémy (Dionex UltiMate 3000 RSLCnano, EASY-nLC 1200) a Orbitrap spektrometry (Q Exactive HF, Exploris 480).
• Acquisition: DDA, PRM a cílená metoda SureQuant s řízením detekce pomocí interních standardů.

Hlavní výsledky a diskuse

• Systémový vhodnostní standard poskytuje spolehlivou kontrolu výkonnosti LC-MS/MS před analýzou neznámých vzorků.
• Multipathway standard umožnil detekci a kvantifikaci 131 fosforylačních událostí napříč drahami EGFR/HER, RAS-MAPK, PI3K/AKT/mTOR, AMPK, apoptóza a stresových kaskád.
• Optimální obohacení bylo dosaženo přidáním standardů před Hi-Select Fe-NTA agarozy, čímž se zvýšila citlivost oproti PRM a DDA až čtyřnásobně.
• Cílená metoda SureQuant nabízí lepší poměr citlivosti a přesnosti pro nízce abundantní fosfopeptidy než klasické PRM/DDA přístupy.

Přínosy a praktické využití metody

• Integrovaný workflow od přípravy vzorku až po cílenou akvizici umožňuje robustní a reprodukovatelné kvantifikace fosforylace.
• Standardizace postupu usnadňuje mezi-laboratorní srovnání a kontrolu kvality v průmyslových i akademických aplikacích.
• Vysoká citlivost a specifičnost cílené analýzy podporuje studium signálních drah v kontextu výzkumu, vývoje léčiv a klinické proteomiky.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření panelů standardů o nové fosfosites a dráhy pro komplexnější pokrytí signálních sítí.
• Integrace s datově nezávislou akvizicí (DIA) a pokročilou bioinformatikou pro ještě hloubkovější analýzu fosfoproteomu.
• Využití v klinických studiích jako nástroj pro identifikaci biomarkerů a personalizovanou medicínu.

Závěr

Metoda SureQuant s multipathway a vhodnostními standardy představuje citlivý, přesný a uživatelsky přívětivý přístup k cílené analýze fosforylace. Díky standardizovaným postupům a vylepšené citlivosti umožňuje detailní kvantifikaci klíčových signálních fosforylačních událostí.