Expanding the Coverage of Metabolome Using Multiple Liquid Chromatography Modes

Význam tématu

Masově spektrometrická metabolomika vyžaduje široké rozlišení a detekci různorodých endogenních malých molekul. Kombinace různých chromatografických přístupů (reverzní fáze, HILIC, mixed-mode) rozšiřuje pokrytí metabolomu a zlepšuje citlivost i selektivitu měření.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo komplexně porovnat tři LC režimy (RPLC, HILIC, mixed-mode) při analýze panelu 300 endogenních metabolitů. Studie ilustrovala, které třídy sloučenin jsou optimálně separovány v každém režimu a jak vzájemně doplňují chromatografický profil.

Použitá metodika a instrumentace

Všechny experimenty probíhaly na systému Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 HPG LC v tandemu s hmotnostním spektrometrem Thermo Q Exactive Orbitrap. Data byla získaná v režimu full scan s pozitivně/negativním ESI přepínáním (70 000 FWHM) a cíleným MS/MS (35 000 FWHM).

Použitá instrumentace

• LC systém: Thermo Dionex UltiMate 3000 HPG
• MS detektor: Thermo Q Exactive Orbitrap
• Kolony: Hypersil Gold C18 (150×2,1 mm, 1,9 µm), SeQuant ZIC-pHILIC (150×2,1 mm, 5 µm), Acclaim Trinity P1 (100×2,1 mm, 3 µm)
• Mobilní fáze: 0,1 % kyselina mravenčí v H2O/MeOH pro RPLC, 10 mM AcONH4 v H2O/ACN pro HILIC, variabilní poměry AcONH4 ve vodě/ACN pro mixed-mode

Hlavní výsledky a diskuse

Na RPLC byly metabolity rozděleny do tří kategorií: RP-Green (nepolární, symetrické špičky, dobrá retence), RP-Yellow (polární, rychlý eluce bez retence) a RP-Red (špatné chromatografické charakteristiky: dělení špiček, broadenování, slabý signál). HILIC a mixed-mode režimy kompenzovaly slabiny RPLC zejména u vysoce polárních a iontových metabolitů. Studie také ukázala význam volby vzorkovacího rozpouštědla (např. 50/50 MeOH/H2O vs. 10 % MeOH) pro optimalizaci tvaru špiček na různých kolonkách.

Přínosy a praktické využití metody

• Efektivní rozšíření metabolitického pokrytí díky vzájemné doplňkovosti tří režimů
• Zvýšení reprodukovatelnosti a citlivosti analýzy polaritě specifických sloučenin
• Možnost tvorby univerzálních protokolů pro rutinní aplikace v QA/QC a výzkumu

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace ultrarychlých gradientů a nano-LC pro zvýšení průchodnosti a citlivosti
• Rozvoj multidimenzionálních LC–MS metod s paralelní detekcí
• Využití pokročilých algoritmů pro automatizovanou kategorizaci retence a tvaru špiček
• Propojování s ostatními omickými technologiemi pro holistické mapování metabolického stavu

Závěr

Komplexní porovnání RPLC, HILIC a mixed-mode LC na panelu 300 metabolitů potvrdilo, že kombinace více chromatografických módů zajišťuje optimální pokrytí širokého spektra chemických vlastností. Výběr vhodného rozpouštědla a kolony významně ovlivňuje chromatografickou kvalitu a detekční citlivost.