Fast Analysis of Therapeutic Monoclonal Antibodies, Fragments, and Oxidation Variants Using a Super-Macro Porous Reversed-Phase Column Coupled with an Orbitrap Mass Spectrometer

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAb) představují klíčovou skupinu moderních biologických léčiv díky svým cíleným účinkům. Jejich heterogenita vzniká v důsledku posttranslačních modifikací, například oxidace methioninových reziduí, což ovlivňuje klinickou účinnost a bezpečnost. Rychlá a spolehlivá analýza těchto variant je nezbytná pro kontrolu výrobních procesů a schvalování bioterapeutik.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout zkrácený a robustní analytický protokol pro oddělení intactních mAb a jejich klíčových fragmentů s detekcí oxidovaných forem. Kombinací supermakroporézního reverzní fáze sloupce MAbPac RP s robustním Orbitrap hmotnostním spektrometrem vznikl rychlý LC/MS workflow s chromatografií do deseti minut. Metoda umožňuje přímou analýzu fragmentů bez nutnosti komplexního peptidového mapování.

Použitá metodika

Redukce interchain disulfidů proběhla inkubací mAb s DTT (20 mM) při 37 °C po dobu 30 minut. Papainová digesce (0,04 mg/ml) byla realizována v Tris–HCl pH 7,6 s EDTA a cysteinem při 37 °C po 4 hodinách k získání LC a Fd_x0088_. IdeS proteáza byla aplikována v poměru 1 U enzymu na 1 µg protilátky v pufru fosfát/NaCl pH 6,6 při 37 °C po 30 minutách pro generaci scFc a F(ab')2.

Použitá instrumentace

• Chromatograf: Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 BioRS systém se supermakroporézním MAbPac RP sloupcem 4 µm, 3×50 mm.
• Mobilní fáze A: voda/formiát kyselina/trifluoroctová kyselina 99,88/0,1/0,02 v/v/v, fáze B: acetonitril/voda/formiát kyselina/trifluoroctová kyselina 90/9,88/0,1/0,02 v/v/v/v, lineární gradient 10 minut.
• Hmotnostní spektrometr: Thermo Scientific Q Exactive Plus Orbitrap, ESI zdroj, rozsah m/z 1 000–4 000, rozlišení 17 500 při m/z 200, napětí 3,9 kV, teplota kapiláry 320 °C, přívod plynů nastaven na 45/15 arb. jednotek.
• Software: Protein Deconvolution 2.0 s ReSpect algoritmem pro určení molekulové hmotnosti.

Hlavní výsledky a diskuse

Chromatografie poskytla baseline oddělení všech fragmentů mAb (LC, HC, Fc, Fab, scFc, F(ab')2) během desetiminutového běhu. Orbitrap spektrometr plně rozlišil oxidované těžké řetězce od neoxidovaných variant s hmotnostním rozdílem +16 Da. Zlepšení separace oxidovaných a neoxidovaných fragmentů scFc i Fd_x0088_ bylo dosaženo zvýšením koncentrace TFA v mobilní fázi na 0,1 %. Izotopové distribuce potvrzují přesnou identifikaci modifikací.

Přínosy a praktické využití metody

Navržený protokol zkracuje dobu analýzy mAb a variant na krátký čas vhodný pro rutinní QA/QC laboratoře. Eliminace potřeby rozsáhlého peptidového mapování zjednodušuje workflow, snižuje riziko chyb a zachovává vysokou citlivost. Metoda je vhodná pro monitoring oxidace, stabilitní studie a kontrolu výrobních šarží.

Budoucí trendy a možnosti využití

Příští kroky zahrnují rozšíření metody na detekci dalších posttranslačních modifikací, zejména glykozylace a deamidace. Automatizace přípravy vzorků a integrace do průběžných výrobních procesů umožní on-line monitoring. Aplikace na nově navržené varianty antibody engineering rozšíří paletu sledovaných produktů.

Závěr

Studie předvedla rychlou a robustní LC/MS metodu pro separaci mAb fragmentů a detekci oxidovaných variant. Supermakroporézní MAbPac RP sloupec v kombinaci s Q Exactive Plus Orbitrap spektrometrem umožňuje spolehlivé rozlišení modifikací s hmotnostním rozdílem 16 Da v čase vhodném pro rutinní aplikace.

Reference

• 1. Liu H., Gaza-Bulseco G., Zhou L. Mass Spectrometry Analysis of Photo-Induced Methionine Oxidation of a Recombinant Human Monoclonal Antibody, J Am Soc Mass Spectrom 2009, 20, 525–528.