Why Use HILIC and HIC Chromatography?

Význam tématu

Hydrofobní interakční chromatografie (HIC) a chromatografie na bázi hydrofilních interakcí (HILIC) představují doplňující režimy k běžné reverzní fázi (RPLC). HILIC umožňuje spolehlivou retenci velmi polárních a ionizovatelných látek, zatímco HIC zajišťuje separaci proteinů v jejich nativní formě bez denaturace.

Cíle a přehled studie

Článek shrnuje teoretické principy HILIC a HIC, popisuje vývoj metodik a strategie optimalizace. Ukazuje výběr vhodných kolon, mobilních fází a gradientních protokolů pro široké spektrum analytů od aminokyselin a cukerných struktur až po monoklonální protilátky.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika HILIC staví na adsorpci vodného filmu na polární povrch a rozdělení na základě polarity a iontově-výměnných interakcí. HIC využívá vysokou koncentraci soli k potlačení elektrostatických účinků a eluci proteinů postupným snižováním iontového sílení. K měření se používají bio-inertní LC systémy Agilent, kolony InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z, AdvanceBio Amide HILIC a AdvanceBio HIC, detektory UV/DAD, fluorescenční detektor, ELSD a hmotnostní spektrometry Agilent 6490 LC/QQQ a Ultivo LC/TQ.

Hlavní výsledky a diskuse

V HILIC režimu se eluce řídí obráceně oproti RPLC a dosahuje se lepší separace izobarických a vysoce polárních sloučenin. Úprava podílu akrylonitrilu, pH a pufrovací soli dramaticky mění retenci i selektivitu. AdvanceBio HIC kolony umožňují detailní analýzu intact mAb, jejich fragmentů, posttranslačních modifikací, oxidovaných variant a DAR u ADC. Online 2D-LC/MS spojení HIC a RP eliminuje problémy se solí a zjednodušuje identifikaci neznámých složek.

Přínosy a praktické využití metody

• HILIC rozšiřuje schopnost RPLC analyzovat silně polární a ionizované látky, včetně glykanů.
• HIC zachovává nativní konformaci proteinů a podporuje analýzu kritických kvality atributů monoklonálních protilátek.
• Bio-inertní a MS-kompatibilní kolony a mobilní fáze zvyšují citlivost, reprodukovatelnost a robustnost analýz.

Budoucí trendy a možnosti využití

Propojení HILIC a HIC v multidimenzionálních platformách 2D-LC nabídne komplexní pohled na extrémně složité vzorky. Vývoj nových bio-inertních stacionárních fází a integrace s vysokorychlostními MS systémy přinese vyšší průchodnost a automatizaci, což je klíčové pro QA/QC v biofarmaceutickém sektoru.

Závěr

HILIC a HIC představují cenné doplňky k RPLC pro analýzu polárních sloučenin i proteinů. Správná volba kolony a optimalizace mobilní fáze přináší vyšší selektivitu, citlivost a reprodukovatelnost, což umožňuje robustní charakterizaci od malých metabolitů až po složité bioterapeutika.

Použitá instrumentace

• Agilent InfinityLab bio-inertní LC systémy s PEEK-flowpath
• Kolony InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z, AdvanceBio Amide HILIC, AdvanceBio HIC
• Detektory UV/DAD, fluorescenční detektor, ELSD
• Hmotnostní spektrometry Agilent 6490 LC/QQQ, Ultivo LC/TQ

Reference

Agilent application notes 5991-9271EN, 5994-5949EN, 5994-0199EN