HILIC Chromatography: When and How?

Význam tématu

Hydrofobní interakce v kapalné chromatografii (HILIC) se stává stále důležitější pro analýzu silně polárních a ionizovaných látek, které se v běžném režimu RPLC špatně zachycují. Díky vrstvě vody adsorbované na stacionární fázi HILIC umožňuje odlišné retenční mechanismy (partitioning, ion-exchange) a poskytuje lepší citlivost při spojení s MS detekcí.

Cíle a přehled článku

Autoři představují klíčové principy a doporučení pro použití HILIC, ukazují volbu kolony a optimalizaci mobilní fáze, uvádějí ukázky separací vodorozpustných vitamínů, aminokyselin, sacharidů a dalších polárních sloučenin a shrnují tipy pro péči o kolony a údržbu systému.

Použitá metodika a instrumentace

Pro ukázkové separace byly využity chromatografické systémy Agilent InfinityLab 1260/1290 a Ultivo LC/TQ či 6470 LC/TQ, kombinované s kolonkami Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z, HILIC-OH5 a dalšími fázemi z portfolia Poroshell 120 (2.1×50–150 mm, částice 1.8–4 µm). Mobilní fáze obsahovaly acetonitril, vodu a pufry na bázi octanů či formiátů při různém pH. Detekce byla prováděna DAD (UV / vis), ELSD a především ESI-MS/MS v režimu MRM/dMRM.

Hlavní výsledky a diskuse

• Retenční mechanismus HILIC: polarity mobilní fáze silně ovlivňuje eluci (méně vody = vyšší retence).
• Komplementarita RPLC: HILIC lépe zadržuje polární a ionizované analyty (aminokyseliny, vitamíny, sacharidy), které RPLC neudrží.
• Metodický vývoj: doporučený start 80–90 % acetonitrilu, pufry acetátové/formiátové (10–30 mM), pH volené podle pKa analyzovaných kyselin či bází.
• Vliv injekčního rozpouštědla: silný organický podíl zhoršuje tvary píků – doporučeno vysoké % ACN ve vzorcích a malé objemy injekce.
• Úpravy pro kovově citlivé sloučeniny: bio-inertní modulace (PEEK-vybavení, de­aktivátor Agilent) snižuje interakce s kovem a zlepšuje citlivost LC/MS.

Přínosy a praktické využití metody

• Rozšíření analytických možností pro QA/QC v potravinářství, farmaceutickém, environmentálním a biomedicínském výzkumu.
• Rychlá a robustní separace polariticky odlišných sloučenin bez nutnosti derivatizace.
• MS-kompatibilita mobilních fází podporuje nízké meze detekce.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další vývoj nových stacionárních fází s pokročilými funkcemi (zwitterionické, PEEK-lined, chiralita).
• Integrované bioinertní systémy pro minimalizaci artefaktů a zvýšení citlivosti v LC/MS.
• Automatizované nástroje metodického vývoje a simulace pro zrychlení optimalizace HILIC metod.

Závěr

HILIC představuje efektivní alternativu k RPLC pro polární a ionizované analyty, umožňuje zlepšenou retenci, separaci i citlivost při MS detekci. Správná volba kolony, mobilní fáze a údržba systému jsou klíčové pro dlouhodobou robustnost a opakovatelnost metod.

Reference

• Agilent Application Note 5991-9271EN: HILIC Method Development and Troubleshooting
• Agilent Application Note 5991-8984EN: Analysis of Sugars Using Poroshell 120 HILIC-Z
• Agilent Application Note 5991-8780EN: Analysis of Water-Soluble Vitamins on Poroshell 120 HILIC-OH5
• Agilent Application Note 5991-8602EN: Analysis of Inorganic Ions on Poroshell 120 HILIC-Z