Complete characterization of a lysine-linked antibody drug conjugate by native LC/MS intact mass analysis and peptide mapping

Význam tématu

Charakterizace antibody–drug konjugátů (ADC) je klíčová pro zajištění účinnosti a bezpečnosti bioterapeutik. ADC kombinují specifické navázání monoklonální protilátky na nemocí postižené buňky s doručením cytotoxických látek. Vysoká heterogenita vznikající náhodnou konjugací na lyzinových zbytcích a přirozenou glykosylací protilátky klade nároky na analytické postupy.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo komplexně charakterizovat lysinově vázaný ADC trastuzumab emtansine (Kadcyla®) za pomoci jediné benchtop hybrydní štěrbinově–Orbitrapové hmotnostní spektrometrie. Klíčové parametry zahrnovaly stanovení poměru náboj–protilátka (DAR), profil glykosylace a lokalizaci konjugovaných míst pomocí peptide mappingu a analýzy intact mass pod „native“ podmínkami.

Použitá metodika a instrumentace

Intact mass analýza:

• Online velikostně vylučovací chromatografie (SEC) na kolonce MAbPac SEC-1 (4,0×150 mm) s 50 mM amonným acetátem (300 µL/min, izokratické eluční podmínky)
• Native ESI spojení na Q Exactive Plus s BioPharma Option, High Mass Range (m/z 2000–8000), rozlišení 70 000 FWHM, 10 mikroskenů

Peptidový mapping:

• Enzymatická digesce SMART Digest kitem (70 °C, 45 min), následná redukce DTT (57 °C, 45 min)
• RP-LC na Acclaim Vanquish C18 (2,1×250 mm, 60 °C, 2–35 % acetonitril/0,1 % FA v 60 min, 0,25 mL/min)
• MS v Standard modu, MS1 70 000 FWHM, MS/MS 17 500 FWHM, top-5 datově dependentní scan

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific Vanquish Binary Pump H, Split Sampler FT, Column Compartment H
• MAbPac SEC-1, Acclaim Vanquish C18
• Q Exactive Plus hybridní kvadrupól-Orbitrap s BioPharma Option
• SMART Digest Kit

Hlavní výsledky a diskuse

Native LC/MS poskytla výrazně lepší oddělení nabitých stavů (23+ až 27+) pro intact ADC ve srovnání s denaturačními podmínkami. Dekonvoluce pomocí algoritmu ReSpect se Sliding Window integrovala šum a částečné chromatografické rozdělení izoforem umožnilo spolehlivou kvantifikaci. Identifikována distribuce 0–8 konjugovaných MCC-DM1, průměrné DAR 3,65. Navíc byl detekován nízkoúrovňový vedlejší produkt bez navázaného DM1 (linker-only, +≈219 Da). Peptide mapping dosáhl 100 % pokrytí sekvence a automaticky identifikoval 30 z 44 lyzinových konjugací. Konjugované peptidy se projevily jako dvojitý elučně chromatografický vrchol a potvrzeny HCD fragmentačním iontem m/z 547,22.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a integrovaná analýza intact hmotností a míst konjugace na jednom přístroji
• Vyšší spolehlivost stanovení DAR a heterogenity ADC
• Minimalizace vzorkové přípravy – native SEC odstraňuje nutnost offline dialýzy
• Možnost odhalit i nízkoúrovňové vedlejší produkty

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření metodiky o iontovou mobilitu pro další rozlišení izoforem, aplikace pro multi-attribute monitoring (MAM), optimalizace SEC fází s minimálními sekundárními interakcemi, automace datové analýzy a hlubší strukturální charakterizace dynamických modifikací.

Závěr

Kombinace native LC/MS intact mass analýzy a peptidového mapování na Q Exactive Plus s BioPharma Option umožňuje komplexní, rychlou a spolehlivou charakterizaci lysinově vázaných ADC včetně DAR, glykosylace, lokalizace konjugací a detekce vedlejších produktů, což podporuje vývoj i kontrolu kvality bioterapeutik.

Reference

• Marcoux J., Champion T., Colas O., Wagner‐Rousset E., Corvaïa N., Van Dorsselaer A., Beck A., Cianférani S. Protein Sci. 2015;24(8):1210–1223.
• Yin Y., Han G., Zhou J., Dillon M., McCarty L., Gavino L., Ellerman D., Spiess C., Sandoval W., Carter P.J. MAbs. 2016;8(8):1467–1476.
• Thompson N.J., Rosati S., Heck A.J. Methods. 2014;65(1):11–17.
• Chen Y., Kim M.T., Zheng L., Deperalta G., Jacobson F. Bioconjug Chem. 2016;27(9):2037–2047.
• Luo Q., Chung H.H., Borths C., Janson M., Wen J., Joubert M.K., Wypych J. Anal Chem. 2016;88(1):695–702.