Kinase inhibition screening by label-free mass spectrometry employing the MALDI PharmaPulse HTS solution

Význam tématu

MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie bez značení se stává klíčovou metodou pro rychlé a efektivní vysokopropustné testování v oboru objevování léčiv. Nabízí cennou výhodu přímého sledování hmotnostní změny při fosforylaci substrátových peptidů, čímž minimalizuje falešné nálezy a snižuje náklady na další validaci.

Cíle a přehled studie

Cílem studie je ukázat schopnosti platformy Bruker MALDI PharmaPulse v kombinaci s instrumentem rapifleX pro in-vitro skríning inhibice lidské tyrosin kinázy ABL. Studie demonstruje vysokou rychlost (<1 s na vzorek), přesnost a robustnost metody při analýze velkých knihoven látek.

Použitá metodika

• Biochemická reakce sledovala fosforylaci peptidu EAIYAAPFAKKK (MW 1336 Da) na EAIpYAAPFAKKK (MW 1416 Da) katalyzovanou kinázou ABL.
• Složení reakčního pufru zahrnovalo ATP, kofaktor a enzym v mikromolárních koncentracích, reakce byla quenched trifluoroctovou kyselinou.
• Příprava vzorku proběhla ředěním 1:100 v kompatibilním bufferu, nanesením na předstrukturované MALDI destičky a aplikací HCCA matice.

Použitá instrumentace

• Bruker rapifleX MALDI-TOF s 10 kHz smartbeam 3D laserem a autoloadérem pro automatickou výměnu destiček.
• MALDI PharmaPulse software (verze 2.2) pro kompletní řízení HTS workflow včetně nastavení kampaně, zpracování dat a exportu výsledků.
• flexAnalysis 4.0 a flexControl 4.0 pro akvizici a automatizované zpracování surových spekter.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla výkonu až 10 vzorků za sekundu s rozlišeným monitoringem substrátu a produktu, což potvrdily hodnoty Z´ kolem 0,7 a RSD pod 7 %. Enzymové titrace a časové studie ukázaly lineární závislosti konverze na množství enzymu a čase inkubace. Profil 40 referenčních inhibitorů prokázal průměrné RSD 12 %. Křivky odezvy a vypočtené IC50 pro PP2, staurosporine, imatinib a dasatinib byly v souladu s 33P radioizotopovou referencí.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí výrazné úspory času a nákladů v HTS laboratořích, snížení falešných kladů a integraci s LIMS a softwarovými nástroji pro pokročilou analýzu (např. Genedata Screener).

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření aplikace na další kinázy a fosfatázy s různými substráty.
• Plná automatizace přípravy vzorků a miniaturizace pro ultra-vysokou propustnost.
• Využití strojového učení pro rozpoznání a predikci inhibitorových vzorů.

Závěr

Studie potvrzuje, že kombinace rapifleX MALDI-TOF a MALDI PharmaPulse představuje inovativní a spolehlivou platformu pro label-free HTS v oblasti kinázové inhibice. Metoda vyniká v rychlosti, reprodukovatelnosti a kompatibilitě s existujícími laboratorními systémy.

Reference

• Heap RE, Hope AG, Pearson L-A, Reyskens KMSE, McElroy SP, Hastie CJ, Porter DW, Arthur JSC, Gray DW, Trost M (2017). SLAS Discovery, 22(10): 1193-1202. doi:10.1177/2472555217717473
• Beeman K, Baumgärtner J, Laubenheimer M, Hergesell K, Hoffmann M, Pehl U, Fischer F, Pieck J-C (2017). SLAS Discovery, 22(10): 1203-1210. doi:10.1177/2472555217727701
• Winter M, Bretschneider T, Kleiner C, Ries R, Hehn JP, Redemann N, Luippold AH, Bischoff D, Büttner FH (2018). SLAS Discovery, 23(6): 561-573. doi:10.1177/2472555218759267
• Winter M, Ries R, Kleiner C, Bischoff D, Luippold AH, Bretschneider T, Büttner FH (2018). SLAS Technology, 24(2): 209-221. doi:10.1177/2472630318791981