Label-free compound profiling in K562 leukemia cells by MALDI-TOF mass spectrometry using heme B as response marker

Význam tématu

MALDI-TOF MS bez značení nabízí rychlou a citlivou analýzu biomolekul přímo ve vzorcích buněk. Díky vysoké rychlosti a schopnosti skenovat stovky sloučenin současně se technika prosazuje jako alternativa ve farmaceutickém screeningu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem této aplikace bylo vyvinout pohotový a automatizovaný buněčný screeningový test pro hodnocení účinku inhibitorů kinázy BCR-ABL v K562 buňkách. Jako marker odezvy byl zvolen heme B, indikátor erytroidní diferenciace, měřený pomocí rapifleX MALDI PharmaPulse.

Použitá metodika a instrumentace

• Odběr buněk: Kultivace K562 v RPMI-1640, 10 % FCS, seeding 0,1×10^6 buněk/ml do 96-jamkových desek, 48h inkubace s imatinibem, dasatinibem, chloroquinem nebo DMSO.
• Automatizace: Robot CyBio FeliX pro přesné přidání látek a transfer buněk na MALDI desku (384 jamkový formát).
• Matrice: 2,5-dihydroxybenzoová kyselina (DHB) 20 mg/ml v ACN/voda (1:1) s 0,5 % TFA, nanášena HTX TM sprayer (50 °C, 60 µl/min, 4 průchody).
• Měření MALDI-TOF MS: rapifleX MALDI PharmaPulse, rozsah 500–1000 Da, pozitivní iontový mód, 2 kHz, 4000 laserových pulzů, náhodný režim, sběr na 2,5 GS/s.
• Validace: solariX XR 7T MRMS pro potvrzení m/z 616,177 pro heme B (rozsah 150–3000 Da, 1 kHz, 100 pulzů).

Hlavní výsledky a diskuse

Peak m/z 616,2 odpovídající heme B se ukázal jako spolehlivý marker. Imatinib a dasatinib vyvolaly koncentraci závislý nárůst signálu, zatímco chloroquine a nosný roztok žádnou změnu neindukovaly. Hodnoty pIC50 byly pro imatinib 7,1 ± 0,1 a pro dasatinib 9,8 ± 0,1, v souladu s literaturou. Přímé měření na buněčném materiálu bez nutnosti čištění potvrdilo robustnost metody.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje rychlý, vysoce propustný a bez značení test farmakodynamické odezvy v živých buňkách. Díky automatizaci a eliminaci čistících kroků se zkracuje doba přípravy a snižují náklady na screening.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření přístupu na další buněčné typy a biomarkerové panely (lipidy, metabolity). Integrace strojového učení pro analýzu komplexního spektra otevře cestu k cílenějšímu vyhodnocení farmakologických účinků. Široké uplatnění v QA/QC a personalizované medicíně je reálné díky možnosti multiplexního měření.

Závěr

Automatizovaný buněčný assay založený na rapifleX MALDI-TOF MS s využitím heme B jako markeru poskytuje spolehlivý a efektivní nástroj k hodnocení inhibitorů BCR-ABL. Metoda kombinuje rychlost, citlivost a jednoduchou přípravu vzorků bez nutnosti sériového čištění.

Reference

• [1] Beeman K. et al. Integration of an In Situ MALDI-Based High-Throughput Screening Process. SLAS Discov 2017, 22:1203–1210.
• [2] Haslam C. et al. The Evolution of MALDI-TOF MS toward Ultra-High-Throughput Screening. J Biomol Screen 2016, 21:176–186.
• [3] Winter M. et al. Establishing MALDI-TOF as Versatile Drug Discovery Readout. SLAS Discov 2018, 23:561–573.
• [4] De Cesare V. et al. The MALDI-TOF E2/E3 Ligase Assay as Universal Tool for Drug Discovery. Cell Chem Biol 2018, 25:1117–1127.
• [5] Weigt D. et al. Automated analysis of lipid drug-response markers by whole cell MALDI. Sci Rep 2018, 8:11260.
• [6] Munteanu B. et al. Label-free in situ monitoring of HDAC drug target engagement. Anal Chem 2014, 86:4642–4647.
• [7] Deininger M. et al. The development of imatinib as a therapeutic agent for CML. Blood 2005, 105:2640–2653.
• [8] Hegedus C. et al. Interaction of nilotinib, dasatinib and bosutinib with ABC transportéry. Br J Pharmacol 2009, 158:1153–1164.