Profiling mammalian cell differentiation by MALDI-TOF MS: Developing a highly reproducible and robust sample preparation workflow

Význam tématu

Matrix‐assisted laser desorpce/ionizace time‐of‐flight (MALDI‐TOF) hraje klíčovou roli v analytické chemii a farmacii zejména díky schopnosti rychle, bez značení a s nízkou spotřebou vzorku profilovat biologické materiály. Díky vysoké toleranci vůči běžným pufrům a minimálnímu čištění vzorku se MALDI‐TOF MS stává ideální metodou pro vysokopropustné skríningové (HTS) aplikace při objevování nových léčiv a fenotypování buněk.

Cíle a přehled studie / článku

• Navrhnout univerzální a vysoce reprodukovatelný pracovní postup přípravy vzorků pro analýzu savčích buněk pomocí MALDI‐TOF MS.
• Optimalizovat klíčové parametry: manipulaci se vzorkem, volbu matrix a postupy fixace buněk.
• Ověřit schopnost rozlišit mezi základním (naïvním) a diferencujícím se stádiem kmenových buněk myší embryonálních kmenových buněk (mESCs).
  

  Použitá metodika a instrumentace

  
  
  • Buňky: čtyři lidské buněčné linie (HEK293, U2OS, MCF7, THP-1) pro optimalizaci protokolu.
  • Příprava vzorku: suspenze 1 × 106 buněk/mL, centrifugace, cyklus zmrazení-rozmrazení pro permeabilizaci membrán.
  • Volba matrix: srovnání kyseliny sinapinové (SA), α-kyanhydroxycaffeové (CHCA) a dihydroxybenzoové (DHB) v různých koncentracích.
  • Optimální buňky na místo: 50–2000 buněk na spot pro maximální intenzitu a počet detekovaných signálů.
  • Instrumentace: rapifleX MALDI PharmaPulse (Bruker Daltonics), lineární pozitivní mód, laser 10 kHz, 10 000 ran v náhodném vzorkovacím vzoru.
  • Software: FlexAnalysis 4.0 pro předzpracování, Perseus a vlastní skripty pro statistickou analýzu.
  
  

  Hlavní výsledky a diskuse

  
  
  • Cyklus zmrazení-rozmrazení významně zvyšuje počet detekovaných hmotností (o 50–80 %) díky permeabilizaci buněk.
  • Matrix CHCA poskytuje nejvyšší počet spektrálních znaků, nejlepší poměr signál/šum a vysokou reprodukovatelnost (> 98 % identifikace nejintenzivnějších peptidů).
  • Obtížně použitelná DHB vykazovala vysokou variabilitu, SA byla středně výkonná.
  • PCA a hierarchické shlukování jasně rozlišily naïvní mESCs od diferencujících se populací díky několika specifickým signálům v oblasti m/z.
  
  

  Přínosy a praktické využití metody

  
  
  • Rychlá a bez značení: analýza od kultivace k datům za méně než hodinu.
  • Vysoká citlivost: detekce proteomických změn i při nízkých počtech buněk.
  • Reprodukovatelnost: vhodné pro HTS, screening malých molekul a farmakologická testování.
  • Možnost automatizace: použití robotických pipetovacích systémů pro zvýšení propustnosti.
  
  

  Budoucí trendy a možnosti využití

  
  
  • Další rozšíření na screening ARNi, CRISPR fenotypů a organoidů.
  • Integrace s dalšími MS technikami pro získání hloubkové proteomické charakterizace.
  • Vývoj standardizovaných kitů pro klinické a komerční laboratoře.
  • Využití umělé inteligence a strojového učení pro automatizovanou interpretaci spekter.
  
  

  Závěr

  
  Systematická optimalizace přípravy vzorků s využitím cyklu zmraz-rozmraz a výběrem matrix CHCA vedla k robustní, citlivé a rychlé metodě pro fenotypování savčích buněk pomocí MALDI-TOF MS. Tento postup nabízí vysokou míru reproducibility, je vhodný pro vysokopropustné skríningy a má významný potenciál pro automatizaci v objevování nových léčiv a buněčných assay.
  
  

  Reference

  
  
  1. Ritorto MS et al. Nature Communications 2014;5:4763.
  2. De Cesare V et al. Cell Chemical Biology 2018;25(9):1117–1127.e4.
  3. Winter M et al. SLAS DISCOVERY 2018;23(6):561–573.
  4. Heap RE et al. SLAS DISCOVERY 2017;22(10):1193–1202.
  5. Guitot K et al. Analytical and Bioanalytical Chemistry 2017;409(15):3767–3777.
  6. Weigt D et al. Cell Chemical Biology 2019.
  7. Winter M et al. SLAS DISCOVERY 2019;24(7):742–752.
  8. Tyanova S et al. Nature Methods 2016;13:731–740.
  9. Chen X et al. Scientific Reports 2017;7:17432.
  10. Heap RE et al. Analyst 2019;144(21):6371–6381.