UPLC-MS/MS Analysis of Methotrexate in Plasma and Serum for Clinical Research

Význam tématu

Methotrexát je klíčovým antifolátem využívaným v léčbě různých malignit a jeho přesné stanovení v krevních matricích je zásadní pro monitorování terapeutické účinnosti a bezpečnosti vysokodávkované terapie. Tradiční imunochemické metody mohou zkreslovat koncentrace methotrexátu v přítomnosti metabolitu DAMPA, zejména po aplikaci enzymu glucarpidázy, což podtrhuje potřebu vysoce selektivní analytické techniky.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem popsané práce je vyvinout a ověřit rychlou a robustní UPLC–MS/MS metodu pro kvantifikaci methotrexátu v lidské plazmě a séru v klinickém výzkumu. Studie hodnotí analytickou selektivitu, citlivost, přesnost, linearitu a odolnost vůči maticovým efektům, a zároveň porovnává výsledky s imunotestem během sledování pacientů léčených vysokou dávkou methotrexátu a glucarpidázou.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky plazmy nebo séra (50 µl) byly připraveny deproteinací metanolovým roztokem obsahujícím stabilní izotopový interní standard methotrexát-2H3. Po centrifugaci byl supernatant naředěn vodou a analyzován isokratickou UPLC separací během 5 minut na kolonce ACQUITY UPLC HSS C18 SB (2,1 × 30 mm, 1,8 µm). Detekce probíhala na hmotnostním spektrometru Xevo TQD v režimu MRM.

Seznam použitých přístrojů:

• ACQUITY UPLC I-Class System
• ACQUITY UPLC HSS C18 SB Column (2,1 × 30 mm, 1,8 µm)
• Xevo TQD Mass Spectrometer
• MassLynx Software v4.1
• TargetLynx Application Manager

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza prokázala chromatografické oddělení methotrexátu od hlavních metabolitů 7-hydroxymethotrexátu a DAMPA bez nežádoucího přesahu. Limit kvantifikace byl stanoven na 0,0025 µmol/l (RSD < 20 %). Celková přesnost a opakovatelnost metody (n = 25) byla ≤ 5,5 % RSD v rozsahu 0,1–75 µmol/l. Linearita byla potvrzena mezi 0,0175 a 13 µmol/l. Matricové efekty, vyjádřené maticovým faktorem, byly korigovány interním standardem. Mezi sérem a plazmou byly zjištěny rozdíly do 6,5 % a interference běžných endogenních i exogenních látek nepřekročily přijatelný rozsah obnovy 90–110 %. Klinická aplikace po glucarpidázové terapii odhalila methotrexátový „rebound“, který imunotesty nerozpoznaly.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká selektivita a specifita vůči DAMPA a dalším metabolitům
• Široký dynamický rozsah (0,025–75 µmol/l, možnost 10× ředění)
• Nízký objem vzorku (50 µl) a rychlá příprava
• Rychlá analýza do 5 minut umožňující vysokou propustnost
• Přesné sledování methotrexátové farmakokinetiky při vysokodávkové léčbě

Budoucí trendy a možnosti využití

Metoda může být dále rozšířena pro monitorování dalších antifolátů a jejich metabolitů. Integrace automatizované přípravy vzorků a pokročilé datové analýzy umožní personalizované dávkovací protokoly. Dále se otevírá prostor pro validaci v širokém spektru klinických studií a v rutinním QA/QC prostředí.

Závěr

Vyvinutá UPLC–MS/MS metoda nabízí rychlé, citlivé a vysoce selektivní stanovení methotrexátu v plazmě a séru s minimálními maticovými interferencemi. Její aplikace odhaluje důležité farmakokinetické jevy po glucarpidázové terapii, což zvyšuje přesnost klinického výzkumu a usnadňuje optimalizaci léčby.

Reference

1. Ahmed a Hasan, J Cancer Sci Ther. 2013;5(3):106–12.