A Clinical Research Method for the Analysis of Serum Testosterone and Androstenedione

Význam tématu

Testosteron a jeho prekurzor androstenedion jsou klíčové androgenické steroidní hormony podílející se na vývoji pohlavních znaků a udržování fyziologických procesů. Přesná a reprodukovatelná analýza těchto látek v séru je zásadní pro klinický výzkum, diagnostiku poruch hormonální rovnováhy a hodnocení léčebných postupů.

Metoda založená na UPLC-MS/MS nabízí vysokou selektivitu a citlivost, které umožňují kvantifikovat nízké fyziologické koncentrace testosteronu a androstenedionu. Zavedení standardizace a automatizace přípravy vzorků významně přispívá k harmonizaci výsledků mezi laboratořemi a k eliminaci operátorské variability.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a validovat klinickou výzkumnou metodu pro extrakci a kvantifikaci testosteronu a androstenedionu v lidském séru. Metoda musí být citlivá, selektivní a umožňovat vysokou kapacitu analýzy s minimálními zásahy operátora.

Klíčové body studie:

• Automatizace vzorkového zpracování pomocí Oasis MAX µElution SPE v multiwell formátu na platformě Tecan Freedom Evo 100/4.
• Chromatografická separace na ACQUITY UPLC I-Class systému s C18 kolonou.
• Detekce na Xevo TQD tandemovém kvadrupólovém hmotnostním spektrometru s režimem Multiple Reaction Monitoring.
• Ověření přesnosti metody pomocí vzorků z programu CDC Hormone Standardization (HoSt).

Použitá instrumentace

• ACQUITY UPLC I-Class s HSS SB C18 kolonnou (2.1 × 50 mm, 1.8 µm).
• Xevo TQD tandemový kvadrupólový hmotnostní spektrometr.
• Automatizační stanice Tecan Freedom Evo 100/4 pro SPE extrakci.
• Softwarové nástroje MassLynx v4.1 s TargetLynx Application Manager.

Použitá metodika

Vzorky lidského séra jsou nejprve ošetřeny interními standardy (C13 označené analogie) a precipitovány směsí amoniaku, síranu zinečnatého a methanolu. Po centrifugaci se supernatant načte na Oasis MAX µElution SPE destičku, umyje roztokem methanolu s amoniakem a analyty eluují krátkou dávkou methanolu a vody.

Chromatografický běh trvá 3,3 minuty při gradientu vody a methanolu s aditivy (2 mM NH4Ac, 0,1 % kyseliny mravenčí). Ionizace je prováděna v režimu pozitivního ESI, detekce MRM přechodů pro kvantitativní i kvalitativní kanály.

Hlavní výsledky a diskuse

Selektivita metody byla demonstrována oddělením testosteronu od jeho epimeru epitestosteronu a dalších příbuzných steroidů bez pozorovatelných interferencí. Citlivost umožňuje kvantifikaci na úrovni 0,17 nmol/L se stabilním poměrem signál/šum >10:1.

Precision (RSD) pro tri-level QC (0,52; 3,5; 35 nmol/L) byla ≤4,0 % pro testosteron a ≤4,7 % pro androstenedion. Metoda vykázala lineárnost v rozsahu 0,17–52 nmol/L (r2 >0,994). Matrixové efekty byly kompenzovány interními standardy, výsledný net matrix effect se pohyboval kolem 1,00.

Ověření metodiky na vzorcích CDC HoSt pro testosteron ukázalo korelaci r2 = 0,999 a průměrné zkreslení 3,3 %, což je v rámci přijatelných limitů ±6,4 %. Srovnání s jinou LC-MS/MS metodou ukázalo mírnou proporcionální odchylku pro testosteron (Demingova regrese y=1,07x+0,04) a dobré shody pro androstenedion (y=0,96x+0,08). Manualní a automatizovaná SPE extrakce byly ekvivalentní.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká analytická selektivita a citlivost vhodná pro klinické výzkumné studie i široké spektrum analýz hormonů.
• Automatizace přípravy vzorků zlepšuje opakovatelnost, snižuje pracovní náročnost a riziko lidské chyby.
• Možnost harmonizace výsledků mezi laboratořemi díky použití standardizovaných calibrátorů CDC HoSt.
• Krátký analytický čas (3,3 min) podporuje vysokou propustnost vzorků.

Budoucí trendy a možnosti využití

Dalšími směry mohou být rozsáhlejší multiplexní analýzy steroidního panelu v jednom běhu UPLC-MS/MS, integrace do klinických workflow pro diagnostiku poruch reprodukčního zdraví či endokrinních onemocnění. Vývoj standardních referenčních materiálů a rozšíření programu HoSt o nové analyty podpoří další harmonizaci mezi laboratořemi.

Pokročilé platformy s vyšším rozlišením masové spektrometrie (HRMS) a hybridní techniky by mohly nabídnout ještě větší selektivitu a možnost nečekaných objevů nových metabolitů.

Závěr

Byla vyvinuta a validována robustní, citlivá a selektivní metoda pro kvantifikaci testosteronu a androstenedionu v séru. Využití automatizované SPE extrakce a UPLC-MS/MS detekce zajistilo vysokou reprodukovatelnost, přesnost a propustnost analýz, což je klíčové pro klinický výzkum a standardizaci hormonálních analýz.

Reference

1. Foley D., Calton L. A Clinical Research Method for the Analysis of Serum Testosterone and Androstenedione. Waters Corporation; 2015.
2. CDC Hormone Standardization Program (HoSt), United States Centers for Disease Control and Prevention.