Comprehensive analysis of low abundant mannose glycopeptides in peptide mapping of adalimumab

Význam tématu

Glykozylace je zásadní posttranslační modifikace ovlivňující stabilitu, bioaktivitu a imunogenicitu terapeutických protilátek. Kontrola variací glykánových struktur je klíčová pro zajištění kvality a konzistence bioléčiv, a to od vývoje až po sériovou produkci. Nízké zastoupení některých glykoforem, zejména vysokomannózových, představuje analytickou výzvu při standardních RP-LC-MS metodách.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo demonstrovat využití kapilární elektroforézy s elektrosprejem (CESI-MS) za použití systému CESI 8000 Plus spojeného s TripleTOF® 6600+ pro komplexní bottom-up mapování peptidů a glykopeptidů adalimumabu. Studie porovnává schopnost separace a identifikace nízkokoncentrovaných glykoforem s tradičními RP-LC-MS přístupy a hodnotí pokrytí sekvence a detekci posttranslačních modifikací.

Použitá metodika a instrumentace

Peptidová příprava:

• Digestion adalimumabu trypsinem (enzym≤ vzorek 1:20) po redukci DTT a alkylaci IAM.
• Rozřeďování vzorku v 100 mM octanu amonném pH 4 v poměru 1:2 (v/v).

CE-MS parametry:

• Použití Bare-Fused Silica OptiMS kazety, 44 nL injektovaného objemu (~39 ng protilátky).
• Hydrodynamická injekce 5 psi/60 s, separace napětím 15 kV, pH 2.0 (10 % acetic acid) v 50 min běhu.
• Data dependent acquisition (DDA) na TripleTOF 6600+ s NanoSpray III Ion Source, 10 MS/MS cyklů, akumulace 150 ms (MS) a 50 ms (MS/MS).
• Rolling collision energy upravená dle náboje (tabulka CE svažnice) pro optimální fragmentaci glykoforem.

Komparativní LC-MS:

• Waters CSH C18 kolona (2.1×150 mm, 1.7 µm) na ExionLC AD + X500B QTOF, gradient 75 min s formátováním 0.1 % FA ve vodě a acetonitrilu, DDA s 8 MS/MS cykly.

Software:

• Analyst® 1.8.1, ProteinPilot™, PeakView®, BPV Flex 2.0 a Byonic™ pro identifikaci a kvantifikaci glycopeptidů.

Hlavní výsledky a diskuse

CESI-MS umožnila separaci vysokomannózových forem Man5, Man6, Man7 a Man8 od sebe navzájem, což RP-LC-MS nedokáže. Upravená CE křivka zajistila detailní y-iontovou fragmentaci (např. ztráty mannózových zbytků 1041, 879 a 793 m/z) a diagnostické ionty glykánů (204, 366, 528 m/z).
Fucosylované formy G0F, G1F a G2F byly v CESI-MS separovány jasně, zatímco LC-MS nedetekovala nízkou úroveň G2F. Dále bylo identifikováno 10 hlavních glykoforem a minoritní G0, G0F-GlcNAc a G1F-GlcNAc.
Peptidová pokrytí adalimumabu překročila 95 % z méně než 40 ng vzorku. CESI-MS odhalila deamidaci (6 % na peptidu VSVLTVLHQDWLNGK) a oxidaci methioninu (1.2 % na NSLYLQMNSLR). Také se potvrdilo oddělení krátkých a hydrofilních sekvencí (např. VSNK [M+H]+1), které jsou v LC-MS často opomíjeny.

Přínosy a praktické využití metody

• Orthogonální separační princip CZE poskytuje vysoké rozlišení a citlivost při velmi nízkém průtoku (~20 nL/min).
• Jednorázové komplexní mapování glykopeptidů a PTM s minimálním množstvím vzorku.
• Vysoká sekvenční pokrytí a detailní kvantifikace nízkoodborných forem.
• Možnost rutinního monitoringu CQA mAb a biosimilárních produktů v QA/QC prostředí.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na další monoklonální protilátky, fúzní proteiny a biosimilary.
• Integrace DIA akvizičních režimů pro komplexnější kvantifikaci.
• Automatizace workflow pro vysokopropustný screening glykoform a PTM.
• Využití v klinické diagnostice a monitoringu stability bioléčiv.

Závěr

CESI 8000 Plus spojené s TripleTOF® 6600+ představuje robustní a vysoce citlivou platformu pro komplexní peptidové mapování a glykopeptidovou analýzu adalimumabu. Metoda doplňuje a v mnoha ohledech překonává tradiční RP-LC-MS, zejména při detekci nízkoodborných glykoforem a detailní analýze PTM.

Reference

1. RUO-MKT-02-11835-A. Optimized digestion procedure and characterization for monoclonal antibodies and proteins by CESI-MS.
2. Crowdsourcing optimized rolling collision energy curves for ID and SWATH acquisition. Sciex Community Application Discussions.
3. Johnson D. E. Biotherapeutics: Challenges and Opportunities for Predictive Toxicology of Monoclonal Antibodies, Int J Mol Sci. 2018;19(11):3685.
4. Sanda M., Goldman R. Data Independent Analysis of IgG Glycoforms in Samples of Unfractionated Human Plasma, Anal Chem. 2016;88:1018.
5. RUO-MKT-02-9755-A. Analysis of Fluorophore Labeled N-glycans by the Multicapillary C100HT Biologics Analyzer and HILIC-UPLC.
6. Mo J., Yan Q. Understanding the Impact of Methionine Oxidation on the Biological Functions of IgG1 Antibodies Using HDX-MS, Anal Chem. 2016;88:9495.
7. Lew C., Gallegos-Perez JL. Rapid Level-3 Characterization of Therapeutic Antibodies by Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry, J Chrom Sci. 2015;53(3):443.