How to Determine Glycan Profiles of Biopharmaceuticals from Peptide Mapping Data

Význam tématu

Glykozylace je klíčová modifikace terapeutických proteinů, ovlivňující jejich stabilitu, působení a bezpečnost. Detailní profilování glykánů je proto zásadní součást kvality a validace biofarmaceutik. Tradiční metody uvolňují a značí glykany, čímž ztrácíme informace o lokalizaci modifikace v rámci peptidového řetězce. Nový přístup zachovává vazbu mezi peptide a glykánem, což je výhodné zejména pro složité peptidové fúze a glykoproteiny s více místy glykosylace.

Cíle a přehled studie / článku

Studie představuje workflow pro přímou identifikaci glykánových složení přímo z peptide mappingu. Hlavním cílem bylo demonstrovat, že kombinací vysokorozlišující LC-MS/MS na přístroji timsTOF Pro s PASEF a zahřívaným ionizačním zdrojem VIP-HESI lze z jednoho experimentu získat informace o glykanech i lokalizaci v peptidu, bez nutnosti samostatné glykanové analýzy.

Použitá instrumentace

• UHPLC Elute s columna Acquity CSH C18 (2.1×100 mm, 1.7 µm)
• Mass spektrometr timsTOF Pro s PASEF
• VIP-HESI (Vacuum Insulated Probe – Heated ESI)
• BioPharma Compass 2021b s Peptide Mapping metodou
• GlycoQuest glykanový vyhledávač

Hlavní výsledky a diskuse

Metodika byla validována na referenčním NISTmAb tryptickém digestu. Z rozmezí retenčních časů 5–15 min bylo zpracováno MS/MS spekter a identifikováno 36 různých glykánových složení. Mezi detekovanými strukturami jsou jak nejčastější komplexní G0F, tak nízce zastoupené hybridní a bifukosylované glykany. Výsledky korelují s literárními přístupy uvolněných a označených glykánů, přičemž PASEF umožnil zachytit signály až při dynamickém rozsahu 100:1.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje:

• Zachovat informaci o lokalizaci glykosylace v peptidovém řetězci.
• Snížit režii a dobu analýzy díky eliminaci separátního značení a uvolňování glykánů.
• Dosáhnout vysoké citlivosti a rozsahu při analýze koelujících glykopeptidů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Aplikace lze rozšířit na složitější glykoproteiny s více místy glykosylace, například na proteiny s epizody SARS-CoV-2. Kombinace PASEF, ion mobility a pokročilého software otevírá cestu k úplnému glykoprofilu přímo z proteolytických map.

Závěr

Popsaný přístup spojuje standardní peptide mapping s glykanovou analýzou bez ztráty polohové informace. Díky vysoké rychlosti PASEF a citlivosti VIP-HESI bylo možné identifikovat 36 glykánových variant z jednoho experimentu, což odpovídá výsledkům tradičních postupů. Metoda je snadno implementovatelná v běžných laboratořích a přináší zkrácení pracovního postupu i vyšší informační hodnotu.

Reference

• [1] Hinneburg H. et al., J Am Soc Mass Spectrom, 2016, optimalizace kolizních energií pro glykopeptidovou analýzu.
• [2] Hilliard M. et al., mAbs, 2017, úplná glykanová charakterizace NISTmAb.
• [3] Meier F. et al., Mol Cell Proteomics, 2018, technologie PASEF na ion mobility spektrometru.
• [4] Gstöttner C. et al., Anal Chem, 2021, charakterizace RBD domén SARS-CoV-2.