Optimized digestion procedure and characterization for monoclonal antibodies and proteins by CESI-MS

Význam tématu

Peptidové mapování je zásadní metoda pro charakterizaci monoklonálních protilátek a proteinových terapeutik. Pomáhá odhalit aminokyselinové sekvence, modifikace a kritické atributy kvality, jako jsou glykozylace, oxidace či deamidace, které ovlivňují bezpečnost a účinnost bioléčiv.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem technické poznámky je představit optimalizovaný protokol štěpení protilátek enzymem trypsinem a jejich analýzu pomocí kapilární elektroforézy s nanoesprayi hmotnostní spektrometrií (CESI-MS). Studie se zaměřuje na modelovou monoklonální protilátku adalimumab a popisuje doporučené podmínky přípravy vzorku, separace i detekce.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorku byly použity redukční činidlo DTT, alkylace IAA a surfaktant RapiGest SF pro zlepšení štěpení. Hydrolytická štěpení probíhala s trypsinem při 37 °C. Pro separaci peptidů a jejich identifikaci sloužila soustava CESI 8000 Plus spojená se zdrojem NanoSpray Ion Source III a hmotnostním spektrometrem TripleTOF 6600 Plus. Jako separační prostředí byla použita OptiMS BFS kapilára a technika transientní izotachoforézy pro soustředění vzorku.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla více než 99% pokrytí sekvence adalimumabu při vstupní hmotnosti vzorku kolem 40 ng. CESI-MS prokázala schopnost rozlišit velmi hydrofobní i hydrofilní peptidy, včetně nízce zastoupených vysokomannózních glykoproteinů. Deamidace byla detekována na vybraných peptidech v rozsahu 2,9 až 3,2 procenta, oxidace methioninu dosáhla 8,6 procenta celkového množství daného peptidu.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká sekvenční pokrytí monoklonálních protilátek v jediném analýzním běhu
• Schopnost simultánně sledovat různé posttranslační modifikace bez nutnosti dalších metod
• Minimální spotřeba vzorku v nanolitrovém rozsahu při vynikající citlivosti
• Komplementární informace oproti tradičním LC-MS postupům

Budoucí trendy a možnosti využití

Vývoj se zaměří na rozšíření metodiky o různé proteázy a automatizaci přípravy vzorku. Integrace se systémy s vyšším rozlišením hmotnostní spektrometrie umožní detailnější profilování glykoform a sledování kvality biosimilars ve farmaceutickém průmyslu.

Závěr

Optimalizovaný protokol enzymatického štěpení a CESI-MS analýza poskytují robustní, citlivou a komplementární platformu pro peptidové mapování monoklonálních protilátek. Díky vysoké sekvenční pokrytí a schopnosti detekovat klíčové modifikace je metoda vhodná pro výzkum, vývoj i kontrolu kvality biotherapeutik.

Reference

1. Gahoual R et al. Monoclonal antibodies biosimilarity assessment using transient isotachophoresis capillary zone electrophoresis tandem mass spectrometry Anal Chem 2014
2. Gahoual R et al Rapid and multi level characterization of trastuzumab using sheathless capillary electrophoresis tandem MS MAbs 2013
3. Lew C et al Rapid level 3 characterization of therapeutic antibodies by capillary electrophoresis electrospray ionization MS J Chrom Sci 2015
4. Gahoual R et al Full antibody primary structure and microvariant characterization in a single injection using transient isotachophoresis and sheathless CZE MS
5. Yu YQ et al A complete peptide mapping of membrane proteins Rapid Commun Mass Spectrom Letter 2004
6. CESI 8000 High Performance Separation System User manual 2020
7. SCIEX technical note Comprehensive analysis of low abundant mannose glycopeptides RUO MKT 02 11834 A
8. Improving the detection limits for highly basic neuropeptides using CESI MS RUO MKT 02 7150 A