Accelerating monoclonal antibody peptide mapping with high acquisition speed Orbitrap-based MS

Význam tématu

Peptidové mapování monoklonálních protilátek je klíčovou technikou v biotechnologické a biofarmaceutické výrobě, jelikož dokáže komplexně charakterizovat primární sekvenci a post-translační modifikace (PTM) terapeutických bílkovin. Rychlá a vysoce výkonná analýza bez kompromisu v kvalitě dat je nezbytná pro škálování procesů vývoje, QA/QC a monitorování kritických atributů produktu (CQA).

Cíle a přehled studie

Cílem této studie bylo demonstrovat schopnost Orbitrap Exploris 480 MS kombinovat vysoké rozlišení a rychlost snímání pro peptidové mapování protilátky golimumab s krátkými chromatografickými gradiencí a zachovat přitom plné pokrytí sekvence, identifikaci a kvantifikaci PTM. Studie hodnotila sedm délek gradientů (5–40 min) a porovnávala výsledky z hlediska kvality dat a reprodukovatelnosti kvantifikace různých modifikací.

Použitá metodika a instrumentace

Digestion & sample prep:

• Automatizovaná digestace SMART Digest Trypsin magnetic bulk resin na platformě KingFisher Duo Prime (96-well Deepwell, BindIt software).
• Peptidový nástřik oxidovaného vs. neupraveného golimumabu (500 ppm H2O2 vs. kontrola).

Chromatografie a MS:

• UHPLC Vanquish Horizon se sloupcem Acclaim VANQUISH C18 (2,2 µm, 2,1×250 mm), 0,3 mL/min, 60 °C, gradienty 2–40 % A/B v časech 5–40 min.
• Orbitrap Exploris 480 s BioPharma option: MS1 rozlišení 60 000@m/z 200, MS2 15 000, dd-MS2 Top15, HCD, NCE 28, inkluze nábojů 2–6.
• Software Chromeleon 7.2.10 pro akvizici, BioPharma Finder 3.2 a FreeStyle 1.7 pro analýzu.

Hlavní výsledky a diskuse

• 100% sekvenční pokrytí lehkého a těžkého řetězce golimumabu ve všech gradientech, i při 5min eluci.
• Oxidace methioninů (M51, M113, M261, M437) detekována a kvantifikována s vysokou přesností (< 1,5 ppm) i na krátkých gradientech, M261 téměř kompletně oxidován.
• Deamidace N43 (a vznik succinimidu) a sekundární nižší deamidace N370 jednoznačně rozlišeny díky HRAM-MS; chromatografické oddělení modifikovaných forem trvalo méně než 6 s, přesto byly získány kvalitní MS2 spektra.
• Profil N-glykozylace na N306 („G0F“, „G1F“, „G2F“, Man5 a další) byl při krátkých gradientech konzistentně kvantifikován pro hlavní glycoformy, drobné varianty vykazovaly větší variabilitu.
• 100% konverze N-terminální glutaminu (Q1→pyroGlu) a částečná ztráta C-terminální lysinu (~15–20 %) byla dobře reprodukovatelná napříč všemi gradienty.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká propustnost (5–40 min) bez obětování datové kvality umožňuje rychlé screenování vzorků během vývoje procesů, výběru klonů nebo kontrolních testů.
• Kombinace automatizované digestace a rychlé UHPLC-MS akvizice přináší robustní platformu pro rutinní analýzu CQA v biofarmaceutických laboratořích.
• Integrované datové prostředí (Chromeleon CDS, BioPharma Finder) zkracuje dobu zpracování a usnadňuje reportování výsledků.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Zkracování gradientů pod 5 min pro ultra-high throughput screening, doplněné o paralelní instrumentaci.
• Rozšíření metodiky o IEX-LC-MS pro lepší rozlišení glyko-a tuhých variant.
• Integrace umělé inteligence pro automatickou detekci a klasifikaci neznámých PTM.
• Využití DX-MS (dynamického výběru vzorku) a ion mobility pro detailnější charakterizaci PTM.

Závěr

Metoda vysokorychlostního peptidového mapování pomocí Orbitrap Exploris 480 a Vanquish Horizon UHPLC umožňuje spolehlivou identifikaci a kvantifikaci klíčových PTM monoklonálních protilátek i při krátkých chromatografických gradientech. Kombinace rychlosti, vysokého rozlišení a automatizace přináší efektivní nástroj pro procesní vývoj a rutinní kontrolu kvality biofarmaceutických produktů.

Reference

1. Evaluate Pharma® Marketing Report: World Preview 2018, Outlook to 2024, 11th Edition, June 2018.
2. Wang W. et al. Impact of methionine oxidation in human IgG1 Fc on serum half-life of monoclonal antibodies. Mol. Immunol. 2011;48:806–816.
3. Guan Z. et al. Detection and characterization of methionine oxidation in peptides by CID and ECD. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2003;14:605–613.
4. Haberger M. et al. Assessment of chemical modifications of sites in CDRs of recombinant antibodies. mAbs. 2014;6(2):327–339.
5. Goetze A. M. et al. High-mannose glycans on Fc region increase serum clearance in humans. Glycobiology. 2011;21(7):949–959.
6. Hossler P. et al. Optimal and consistent protein glycosylation in mammalian cell culture. Glycobiology. 2009;19(9):936–949.
7. Huang K. F. et al. Crystal structure of human glutaminyl cyclase for N-terminal pyroGlu formation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005;102(37):13117–13122.
8. Dick L. W. Jr. et al. Origin of N-terminal pyroGlu variation in mAbs using model peptides. Biotechnol. Bioeng. 2007;97(3):544–553.
9. Liu Z. et al. Cyclization of N-terminal glutamic acid impacts mAb charge heterogeneity. J. Pharm. Sci. 2019;108(10):3194–3200.
10. Beyer B. et al. Microheterogeneity of recombinant antibodies: analytics and functional impact. Biotechnol. J. 2018;13:1700476.
11. Brorson K. & Jia A. Y. Therapeutic mAbs and consistent ends: terminal heterogeneity. Curr. Opin. Biotechnol. 2014;25:140–146.