Understanding synthetic biology using the Q Exactive GC Orbitrap GC-MS/MS system and high-resolution, accuratemass metabolomics library for untargeted metabolomics

Význam tématu

Poptávka po produkci speciálních chemických látek v farmaceutickém, zemědělském a výrobním průmyslu roste, a s tím se zvyšují nároky na udržitelné, šetrné a regulacemi řízené procesy. Syntetická biologie nabízí rámec design-build-test pro přetváření bakteriálních buněk na bio-faktory schopné efektivní výroby komplexních sloučenin.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo aplikovat netargetovanou metabolomiku pomocí Q Exactive GC Orbitrap GC-MS/MS k posouzení vlivu typu a koncentrace induktoru IPTG na metabolický profil E. coli DH5α nesoucí plasmid pro expresi červeného fluorescenčního proteinu (RFP) při různých kultivačních podmínkách.

Použitá metodika a instrumentace

• Modelový systém: E. coli DH5α s plasmidem pBbA1a-RFP indukovaný IPTG (25, 50, 100 µM).
• Kultivace: růst na médiích LB a TB, zastavení reakcí metanolem, centrifugace, filtrace.
• Derivatizace: metoximace (metoxyamin v pyridinu) a silylace (MSTFA + 1 % TMCS).

Použitá instrumentace

• Q Exactive GC Orbitrap GC-MS/MS: EI, Full-scan, m/z 50–550, 60 000 FWHM při m/z 200, přesnost < 2 ppm.
• Gas chromatografie: Thermo TRACE 1310 GC, kolona TraceGOLD TG-5SilMS (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm).
• Autosampler: Thermo TriPlus RSH, injekce splitless (280 °C), helium nosné plyn 1,2 mL/min.
• Software: Compound Discoverer pro alignments, PCA a statistiku; TraceFinder pro HRAM knihovnu (900+ standardů) a NIST2017.

Hlavní výsledky a diskuse

• PCA oddělila vzorky podle média (LB vs TB) a indukce (IPTG vs kontrola), čímž demonstrovala vliv promotoru na exo-metabolom.
• ANOVA a Volcano plot identifikovaly 212 významných iontů, z nichž 39 bylo potvrzeno HRAM knihovnou.
• Snížení hladin sacharidů (trehalóza, sorbóza, glukóza, manóza) a aminokyselin (serin, arginin, prolin, tyrosin) po indukci odráží zvýšené nároky na energii a stavební bloky pro syntézu RFP.
• Metabolické změny v TCA cyklu (pokles sukcinátu, akumulace fumarátu a 3-hydroxybutyrátu) naznačují potenciální hrdla a alternativní trasy, například GABA shunt.
• Zvýšená exprese putrescinu svědčí o recyklaci aminokyselin z proteinů jako energeticky úsporné strategii.

Přínosy a praktické využití metody

Netargetovaná GC-MS/MS s vysokým rozlišením a přesnou hmotností umožňuje komplexní profilování malých metabolitů ve složitých vzorcích. Workflow s pravidelnými QC kontrolami a robustními knihovnami zajišťuje spolehlivost a opakovatelnost při optimalizaci bioprodukčních procesů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Optimalizace indukčních podmínek a snižování spotřeby IPTG z hlediska nákladů a ekologického dopadu.
• Integrace multi-omics přístupů a strojového učení pro prediktivní modelování metabolických cest.
• On-line monitorování fermentačních procesů a vysokopropustné screeningy nových promotorů.

Závěr

Studie prokázala, že netargetovaná HRAM GC-MS/MS metabolomika efektivně odhalí dopady inducibilních genetických systémů na bakteriální metabolismus. Identifikované změny poskytují cenné poznatky pro navrhování efektivnějších produkčních kmenů a optimalizaci induktorových protokolů.

Reference

1. Carbonell P. et al. SYNBIOCHEM–a SynBio foundry for the biosynthesis and sustainable production of fine and speciality chemicals. Biochemical Society Transactions 2016;44(3):675–677.
2. Toogood HS. et al. Enzymatic Menthol Production: One-Pot Approach Using Engineered Escherichia coli. ACS Synthetic Biology 2015;4(10):1112–1123.
3. Muhamadali H. et al. Metabolomics investigation of recombinant mTNFα production in Streptomyces lividans. Microbial Cell Factories 2015;14:157.
4. Sumner LW. et al. Proposed minimum reporting standards for chemical analysis. Metabolomics 2007;3(3):211–221.
5. Thermo Fisher Scientific. Application Note 10532, 2016.
6. Carneiro S. et al. Metabolic footprint analysis of recombinant Escherichia coli strains during fed-batch fermentations. Molecular Biosystems 2011;7(3):899–910.
7. Muhamadali H. et al. Metabolomic analysis of riboswitch containing E. coli recombinant expression system. Molecular BioSystems 2016;12(2):350–361.