Simultaneous Quantitation and Discovery analysis: Combining targeted and untargeted metabolomics on Orbitrap mass spectrometers

Význam tématu

Metabolomika poskytuje informace o stavu biologických systémů prostřednictvím měření nízkomolekulárních metabolitů. Kombinace cílených (targeted) a necílených (untargeted) přístupů v jednom experimentu zvyšuje analytickou hodnotu dat: cílené analýzy přinášejí přesné kvantifikace známých biomarkerů, zatímco necílené přístupy umožňují objevovat nové látky a sledovat komplexní metabolické změny. Hybridní přístup SQUAD (Simultaneous Quantitation and Discovery) využívá tato komplementární pozitiva a optimalizuje využití vzorků i přístrojového času, což je zásadní v klinickém výzkumu, nutriční studii, mikrobiomice a průmyslové metabolické inženýrství.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem technické poznámky je popsat pracovní postup SQUAD pro Orbitrap masové spektrometry: návrh experimentu, přípravu vzorků, nastavení akvizice a postupy zpracování dat. Součástí je demonstrační případová studie, kde byl standardizovaný plasmatický materiál (NIST SRM 1950) doplněn širokým rozsahem izotopově značených aminokyselin a organických kyselin, aby se ukázalo, jak lze současně provést absolutní kvantifikaci a necílené objevování v jedné injekci.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorkování a příprava: extrakce plasmy 80 % methanolem (proteinová precipitace), přidání izotopově značených interních standardů, sušení a rekonstituce v předepsaném roztoku.
• Kalibrace: řada ředění autentických standardů s konstantním množstvím interního standardu pro absolutní kvantifikaci; doporučené postupy zahrnují vícebodové kalibrační křivky a replikace pro zajištění robustnosti.
• Kontrola kvality: zpracovací blanky, pooled QC (aliquot z kombinace všech vzorků), SST (system suitability tests), pravidelné vložení QC vzorků během šarže, použití izotopických IS pro kompenzaci matrice a variací extrakce.
• Chromatografie: Vanquish Horizon UHPLC, Hypersil GOLD C18 (2.1×150 mm, 1.9 µm), rychlé gradienty, injekční objem 2 µL, kontrola teploty kolony (45 °C) a autosampleru (5 °C).
• Masová spektrometrie: použitá zařízení a jejich klíčové charakteristiky:
  • Orbitrap Exploris 240 – HRAM MS1, rychlé přepínání polarity; MS1-based kvantifikace LLOQ ~50 fmol, LLOD ~25 fmol, dynamický rozsah ~5 řádů.
  • Orbitrap IQ-X Tribrid – kombinace kvadrupólu, Orbitrapu a lineárního iontového pasti; lineární iontová pasti poskytuje vysokou citlivost (LLOQ ~5 fmol, LLOD ~0.5 fmol), dynamický rozsah ~6 řádů; vhodné pro tMS2/tSIM kvantifikaci a rychlé tMS analýzy.
  • Orbitrap Astral – vysokorychlostní HRAM MS1 + rychlé a citlivé DDA MS2 v Astral analyzátoru; vysoká účinnost fragmentace (≥90 %), LLOQ až 1 fmol a LLOD v atto/zeptomolovém rozsahu pro některé analyty (např. fenylalanin), dynamický rozsah ~6 řádů; umožňuje až třikrát kratší LC gradienty bez ztráty kvality dat a detekuje ~25 % více sloučenin v 5minutu oproti delším gradientům.
• Workflows a software:
  • AcquireX (inteligentní akvizice, automatizované řízení ddMS2 a rozšířené fragmentace QC poolů, cca ~80% pokrytí fragmentací ve workflow).
  • Real-Time Library Search (RTLS) pro rozhodovací spouštění MSn skenů proti lokální nebo offline knihovně (mzVault / mzCloud).
  • TraceFinder (verze 5.1) pro cílenou kvantifikaci – databáze sloučenin, master metody, automatická integrace, reportování a validace kalibrací.
  • Compound Discoverer (verze 3.3) pro necílené objevy – workflow-based zpracování, identifikace přes mzCloud, izotopová formulace, statická a multivariační analýza (t-test, ANOVA, PCA, PLS-DA aj.).

Hlavní výsledky a diskuse

• SQUAD umožňuje současné provedení přesné kvantifikace vybraných metabolitů a hloubkové necílené fragmentační analýzy z jediné injekce, čímž se redukuje variabilita při opakovaných přípravách nebo opakovaných injekcích vzorků.
• V případě studie s NIST SRM 1950 bylo prokázáno, že kombinace izotopově značených interních standardů s HRAM kvantifikací poskytuje široký lineární rozsah a nízké LOD/LLOQ vhodné pro klinické matice jako plasma.
• Orbitrap Tribrid (IQ‑X) přináší výhodu extrémní citlivosti lineárního iontového pasti pro kvantifikaci velmi nízkých koncentrací, zatímco Orbitrap Astral významně zvýšil rychlost a fragmentační pokrytí, což zlepšuje rychlý profiling a identifikaci nízkoabundantních sloučenin.
• AcquireX a RTLS zvyšují efektivitu sběru MS2 dat tím, že směrují instrumentální čas na relevantní ionty a snižují redundantní fragmentace; to výrazně zlepšuje schopnost anotovat neznámé složky.
• Kvalita výsledků je silně závislá na plánování: správná volba interních standardů, důsledné QC (pooled QC, blanky, SST), a korektní nastavení kalibračních křivek jsou rozhodující pro reprodukovatelnost a mezi‑laboratorní porovnatelnost.

Přínosy a praktické využití metody

• Optimalizace práce se vzorky: SQUAD šetří vzorkový materiál a přístrojový čas tím, že kombinuje target i discovery v jedné běhu.
• Vysoká flexibilita: možnost retrospektivního vyhledávání a potvrzení nově objevených kandidátů bez nutnosti nových analýz.
• Široké aplikační spektrum: klinické biomarkery, farmakometabolomika, nutriční studie, mikrobiomová metabolika, metabolické inženýrství a QA/QC v průmyslových laboratořích.
• Zvýšená jistota identifikace: kombinace HRAM, MSn fragmentace a spektrálních knihoven (mzCloud/mzVault) zlepšuje důvěru v anotace a umožňuje dosažení vyšších úrovní identifikace (včetně Level 1 při dostupnosti autentických standardů).

Budoucí trendy a možnosti využití

• Dynamické integrace umělé inteligence a pokročilých algoritmů pro automatizované přiřazování struktur, zlepšení dekonvoluce spekter a predikci fragmentací.
• Rozvoj rychlých, vysoce citlivých detektorů (např. Astral‑like technologie) umožní kratší chromatografické běhy a vyšší throughput bez ztráty hloubky profilu.
• Širší používání inteligentních akvizičních workflow (AcquireX, RTLS) spojeno s rozsáhlými, kurátorskými spektrálními knihovnami pro rychlejší a spolehlivější anotace neznámých sloučenin.
• Standardizace SQUAD protokolů a sdílení metodických šablon mezi laboratořemi pro lepší reprodukovatelnost a mezi‑laboratorní porovnání.
• Možnosti rozšíření na multi-omics integraci, kde SQUAD signály mohou být kombinovány s proteomikou a transkriptomikou pro komplexnější biologické závěry.

Závěr

SQUAD představuje praktický a výkonný přístup, který odstraňuje kompromis mezi cílenou kvantifikací a necíleným objevováním v metabolomice. Využití moderních Orbitrap a Tribrid/Astral platforem společně s inteligentní akvizicí a pokročilými softwarovými nástroji (TraceFinder, Compound Discoverer, AcquireX, RTLS, spektrální knihovny) umožňuje vysokou citlivost, široký dynamický rozsah a robustní identifikaci sloučenin. Implementace robustních QC postupů a vhodné instrumentace zajišťuje reprodukovatelnost výsledků a jejich využitelnost v aplikačních oblastech od klinického výzkumu po průmyslovou analytiku.

Reference

1. Technická poznámka Thermo Fisher Scientific: TN004327 Simultaneous Quantitation and Discovery analysis: Combining targeted and untargeted metabolomics on Orbitrap mass spectrometers (2026).
2. Amer B., et al., Technical note 001771 Quality assurance and quality control in metabolomics: achieving high-quality data for high-quality results (Thermo Fisher Scientific).
3. NIST SRM 1950, Standard Reference Material for human plasma metabolomics.
4. Produktové a softwarové reference použitá v textu: Thermo Scientific Orbitrap Exploris, Orbitrap Tribrid (IQ‑X), Orbitrap Astral, Vanquish UHPLC, Hypersil GOLD C18, AcquireX, TraceFinder v5.1, Compound Discoverer v3.3, mzCloud / mzVault, Cambridge Isotope Laboratories, Sigma‑Aldrich (Merck).