Application of GC Orbitrap mass spectrometry for untargeted metabolomics of pathogenic microorganisms

Význam tématu

Infekce způsobené patogenními bakteriemi a houbami, zejména Staphylococcus aureus a Candida albicans, představují závažný zdravotní problém kvůli tvorbě odolných biofilmů a narůstající rezistenci vůči antibiotikům. Detailní studium metabolických interakcí mezi těmito mikroorganismy může odhalit klíčové biochemické dráhy ovlivňující virulenci a otevřít cestu ke změněným terapeutickým postupům.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem bylo využít nekcílenou metabolomiku založenou na plynné chromatografii spojené s vysokorozlišovací Orbitrap hmotnostní spektrometrií pro identifikaci a kvantifikaci statisticky signifikantních metabolitů v médiích a buňkách kultivovaných samostatně i v ko-kultuře C. albicans se S. aureus. Studie sleduje rozbor změn v extracelulárním i intracelulárním metabolomu a snaží se objasnit chemické signály podporující synergii patogenů.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky buněk a médií byly lyofilizovány a podrobeny dvoustupňové derivatizaci: methoximaci (20 mg/ml methoxyamin HCl, 60 °C, 120 min) a silylaci (MSTFA+1 % TMCS, 80 °C, 120 min). Analýza probíhala v náhodném pořadí s opakovanými QC vzorky pro zajištění reproducibility.

• GC separace: Thermo Scientific TRACE 1310 s kolonkou TraceGOLD TG-5Sil MS (30 m×0,25 mm×0,25 µm).
• Injektor: SSL režim, split 1:100, He 1,0 ml/min, teplota 250 °C, objem 1 µl.
• Oven program: 70 °C (4 min) → 320 °C (20 °C/min, držení 8 min).
• Detekce: Thermo Scientific Q Exactive GC Orbitrap, EI 70 eV, full-scan 50–650 Da, rozlišení 60 000 (m/z 200), vnitřní lockmass m/z 207,03235.
• Automatizace: Thermo Scientific TriPlus RSH s robotickým ramenem.
• Softwarové zpracování: Compound Discoverer pro detekci, alignaci, PCA a Volcano analýzu; TraceFinder pro dekonvoluci, knihovní vyhledávání (NIST, vlastní HR metabolity) a semi-kvantitaci.

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza dat ukázala jasnou separaci medií a buněčných vzorků v PCA s vysokou opakovatelností QC (<20 % RSD). Mezi klíčové nálezy patří:

• Snížené hladiny glycinu ve spent médiu S. aureus.
• Signifikantní zvýšení koncentrace sedoheptulóza-7-fosfátu v ko-kultuře, naznačující jeho úlohu v interakci patogenů.
• Detekce sugar fosfátů, aminokyselin a polyolů (myo-, scyllo-inositol) v intracelulárním metabolomu.
• Potvrzení identifikace spojováno s vysokým skóre NIST (>700) a HRF, doplněné srovnáním s derivatizovanými standardy.

Přínosy a praktické využití metody

Vysoká hmotnostní přesnost sub-ppm, rozsáhlý dynamický rozsah a full-scan citlivost umožňují komplexní nekcílenou metabolomiku za použití komerčních i vlastních knihoven. Rychlý datový tok od analýzy k interpretaci zvyšuje efektivitu laboratorního workflow a usnadňuje objevování biomarkerů v mikrobiálních interakcích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Perspektivní směřování zahrnuje rozšíření spektrálních knihoven s MS/MS daty, integraci s proteomickými a genomickými přístupy, automatizované bioinformatické platformy a aplikaci na další patogeny či polymikrobiální systémy. Vývoj výkonnějších derivatizačních protokolů a miniaturizovaných GC-MS systémů může dále zlepšit citlivost a throughput.

Závěr

Studie prokázala, že GC Orbitrap HRMS platforma Q Exactive GC poskytuje robustní a citlivý přístup pro nekcílenou metabolomiku patogenních mikroorganismů. Identifikace klíčových metabolitů v ko-kultuře C. albicans a S. aureus přináší nové poznatky o jejich biochemické synergii a otevírá cestu k vývoji inovativních terapeutických strategií.

Reference

• Crump JA, Collignon PJ. 2000. Intravascular catheter-associated infections. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 19:1–8.
• Carlson EC. 1988. Synergism of Candida albicans and delta toxin producing Staphylococcus aureus on mouse mortality and morbidity: protection by indomethacin. Zbl Bakteriol Mikrobiol Hyg C. 269:377–386.
• Morales DK, Hogan DA. 2010. Candida albicans Interactions with Bacteria in the Context of Human Health and Disease. PLoS Pathog. 6(4):e1000886.
• Weidt S, Haggarty J, Kean R, Cojocariu CI, Silcock PJ, Rajendran R, Ramage G, Burgess KEV. 2016. A novel targeted/untargeted GC-Orbitrap metabolomics methodology applied to Candida albicans and Staphylococcus aureus biofilms. Metabolomics. (submitted).
• Dunn WB, Broadhurst D, Begley P et al. 2011. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using GC and LC coupled to MS. Nat Protoc. 6(7):1060–1083.
• Thermo Fisher Scientific. 2015. Untargeted Metabolomics Using Orbitrap-Based GC-MS. Application Note 10457.