Understanding Synthetic Biology using the Q Exactive GC Orbitrap GC-MS and a High Resolution Accurate Mass Metabolomics Library for Untargeted Metabolomics

Význam tématu

Vliv syntetické biologie a metabolomických metod na průmyslové i výzkumné aplikace se prohlubuje, protože umožňuje komplexní profilování metabolitů mikrobiálních bioreaktorů. Untargeted metabolomika poskytuje neomezené pohledy na exo-metabolom a odhaluje neočekávané metabolické posuny.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo analyzovat, jak typ a koncentrace induktoru (IPTG) ovlivňuje metabolický otisk Escherichia coli s exprimujícím RFP. Použito bylo netargetované GC-MS s vysokým rozlišením a specializovanou HRAM metabolomickou knihovnou.

Použitá metodika a instrumentace

• Příprava vzorků: Quenching methanolem, centrifugace, lyofilizace, derivatizace methoxymací a silylací (MSTFA+1 % TMCS).
• Chromatografie: Thermo Scientific TRACE 1310 GC s TG-5SilMS kolonkou, běh 33 min., helium 1,2 mL/min.
• Spektrometrie: Q Exactive GC Orbitrap GC-MS, EI 70 eV, režim full-scan (50–550 Da), rozlišení 60 000 FWHM, lockmass 207.03235 m/z.
• Zpracování dat: Compound Discoverer – zarovnání RT, normalizace, PCA, ANOVA, T-HSD, volcano plot; TraceFinder – dekonvoluce, identifikace proti NIST2017 a HRAM knihovně s ΔRI ±100 a skóre >80.

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific TRACE 1310 GC System, TriPlus RSH autosampler, TraceGOLD TG-5SilMS kolonka.
• Q Exactive GC Orbitrap GC-MS, elektronová ionizace, TriPlus RSH injektor.

Hlavní výsledky a diskuse

• PCA ukázala jasné oddělení vzorků podle média (LB vs. TB) a indukce IPTG.
• 39 metabolitů vykázalo statisticky významné změny (p<0,05, log2 FC>1), včetně aminokyselin, organických kyselin a polyaminů.
• Volcano analýza odhalila známé i nečekané metabolické posuny (např. zvýšení putrescinu, pokles serinu).
• Diskuse upozorňuje na potřebu dalších experimentů k rozlišení efektu indukce od efektu produkce proteinu.

Přínosy a praktické využití metody

• Netargetované GC-MS s HRAM knihovnou umožňuje spolehlivou identifikaci a kvantifikaci širokého spektra metabolitů.
• Retenční indexy a přesná hmotnost zvyšují důvěru v identifikaci klíčových biomarkerů.
• Workflow Compound Discoverer a TraceFinder zefektivňuje datovou analýzu pro QA/QC i výzkum.
• Informace lze využít pro optimalizaci biotechnologických procesů a návrh genetických modifikací.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s cílenými metodami (LC-MS) pro komplementární analýzu.
• Časové studie pro sledování dynamiky metabolických posunů během fermentace.
• Rozšíření na jiné mikrobiální systémy a produkované sloučeniny.
• Multimodální přístup propojující metabolomiku, proteomiku a transcriptomiku.

Závěr

Netargetované GC-MS s vysokým rozlišením na platformě Q Exactive GC Orbitrap v kombinaci s HRAM metabolomickou knihovnou umožnilo detailní profilování exo-metabolomu E. coli. Metoda poskytuje robustní platformu pro studium metabolických dopadů indukce genové exprese, ačkoliv další validace je nutná k upřesnění biologických mechanismů.

Reference

• Carbonell P., et al. (2016) SYNBIOCHEM–a SynBio foundry for the biosynthesis and sustainable production of fine and specialty chemicals. Biochem Soc Trans 44(3):675–677.
• Toogood H.S., et al. (2015) Enzymatic Menthol Production: One-Pot Approach Using Engineered Escherichia coli. ACS Synth Biol 4(10):1112–1123.
• Muhamadali H., et al. (2015) Metabolomics investigation of recombinant mTNFα production in Streptomyces lividans. Microb Cell Fact 14(1):157.
• Sumner L.W., et al. (2007) Proposed minimum reporting standards for chemical analysis. Metabolomics 3(3):211–221.
• Thermo Fisher Scientific Application Note 10532 (2016) Application of GC Orbitrap mass spectrometry for untargeted metabolomics of pathogenic microorganisms.
• Carneiro S., et al. (2011) Metabolic footprint analysis of recombinant Escherichia coli strains during fed-batch fermentations. Mol BioSyst 7(3):899–910.
• Muhamadali H., et al. (2016) Metabolomic analysis of riboswitch containing E. coli recombinant expression system. Mol BioSyst 12(2):350–361.