Quantitation of the Aminoglycosides Group of Veterinary Drugs in Milk Samples

Význam tématu

Monitorování reziduí veterinárních antibiotik v potravinách živočišného původu je klíčové pro ochranu veřejného zdraví, prevenci alergických reakcí a omezení rozvoje antimikrobiální rezistence. Aminoglykosidy patří mezi často používaná antibiotika v chovu hospodářských zvířat a jejich silná polarita i tendence tvořit komplexy s kovy představují analytickou výzvu. Validní, citlivé a provozně stabilní LC/MS/MS metody jsou proto nezbytné pro rutinní kontrolu mléka a jiných potravinářských matric.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout robustní, MS‑kompatibilní kvantifikační postup pro skupinu aminoglykosidových veterinárních léků v mléce bez použití ion‑pairing činidel (zejména HFBA), která zhoršují citlivost a zvyšují kontaminaci systému. Metoda má poskytovat spolehlivou retenci a separaci vysoce polárních látek, vysokou průkaznost, dobré zotavení z matrice a vhodné LOQ pro rutinní analýzu.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorový materiál: pasterizované mléko spikeované referenčními standardy (apramycin, erythromycin, kanamycin, spectinomycin, lincomycin, neomycin, spiramycin, tylosin, virginiamycin M1).
• Vzorkovací a extrakční postup: přidání EDTA (0,1 M) pro chelaci divalentních iontů, krátké stání, extrakce 5% trichloroctovou kyselinou v acetonitril/voda (50:50), vortex, centrifugace, filtrace nylonovým filtrem a převedení do vialek.
• Chromatografie: reverzní fáze Agilent InfinityLab Poroshell SB‑AQ (4.6×150 mm, 2.7 µm) s gradientním elucí; mobilní fáze bez HFBA — voda s 4.5 mM ammonium formátu, 0.5 mM ammonium fluoridu a 0.1% kyseliny formové (A) a acetonitril s 0.1% kyseliny formové (B). Průtok 0,5 mL/min, teplota kolony ~30 °C, injekce 20 µL, doba analýzy ~12 min (+ post‑time).
• Detekce: Agilent 6475 triple quadrupole LC/MS se zdrojem ESI v pozitivním módu (Agilent Jet Stream AJS). Kvantifikace prováděna v režimu MRM s optimalizovanými prekurzorovými a produktovými ionty, kolizními energiemi a fragmentačními podmínkami pro každou látku.
• Software: MassHunter pro akvizici a kvantifikaci dat.

Hlavní výsledky a diskuse

• Metoda bez HFBA dosahuje dobré retence a rozlišení analyzovaných aminoglykosidů díky použití polárně upravené RPLC kolony (SB‑AQ) a slabě kyselých/modifikovaných mobilních fází, což snižuje iontové potlačení a systémovou kontaminaci.
• Zařazení EDTA do extrakce výrazně zlepšilo recovery u sloučenin tvořících komplexy s divalentními kovy (zejména u aminoglykosidů), protože chelace snižuje vazby mezi analytem a ionty Ca/Mg v matrici.
• Kalibrační rozsahy a LOQ: pro šest analyzátů (neomycin, erythromycin, lincomycin, tylosin, spiramycin, virginiamycin M1) byla dosažena lineární kvantifikace v rozmezí 2,5–100 ng/mL s LOQ 2,5 ppb. Pro kanamycin, spectinomycin a apramycin byly použity vyšší rozsahy 25–300 ng/mL s LOQ 25 ppb.
• Matrixové efekty byly významné u některých analyzátů; proto byla zavedena kalibrace se standardy spikeovanými před extrakcí (pre‑extraction spiked calibration), která kompenzuje vliv matrice a zabezpečuje přesnost kvantifikace.
• Recoveries z mléčné matrice se pohybovaly přibližně v rozmezí 80–120 %, čímž metoda splňuje běžné akceptační kritéria pro přesnost a zotavení.
• Kontrola kvality pomocí poměru MRM iontů prokázala konzistentnost — poměry zůstaly v rámci ±30 % napříč kalibračními úrovněmi, což svědčí o specifickém sledování analytů a nízké interference.
• Praktická doporučení: apramycin a neomycin mají tendenci adsorbovat na sklo; pro přípravu a skladování standardů je vhodnější voda jako rozpouštědlo a plastové vialky.

Přínosy a praktické využití metody

• Metoda nabízí MS‑přátelskou alternativu k postupům s HFBA, čímž snižuje iontové potlačení, kontaminaci systému a dobu stabilizace přístroje.
• Jednoduchý a rychlý vzorkovací protokol bez složitých SPE kroků zvyšuje průchodnost analytů a vhodnost pro rutinní screeningová pracoviště a kontrolní laboratoře v potravinářství.
• Metoda je použitelná pro monitoring reziduí aminoglykosidů v mléce s LOQ vyhovujícím mnoha regulačním limitům (typicky 10–200 ppb v závislosti na látce a jurisdikci).

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další rozvoj směrem k více‑reziduálním metodám vhodným pro paralelní analýzu širších panelů veterinárních látek by zvýšil efektivitu kontrolních laboratoří.
• Integrace postupů s automatizovanou přípravou vzorků a pokročilými datovými work‑flows (např. řízená kalibrace a korekce matrice) může zlepšit reprodukovatelnost a throughput.
• Vývoj nových stacionárních fází a mobilních fází optimalizovaných pro velmi polární analyty by mohl dále snížit závislost na ion‑pairing činidlech a zvýšit citlivost LC/MS metod.
• Adaptace metody na jiné potravinářské matrice (sérum, maso, vejce) a validace podle mezinárodních norem by rozšířila její aplikaci v regulační praxi.

Závěr

Prezentovaná LC/MS/MS metoda poskytuje robustní, citlivé a provozně výhodné řešení pro kvantifikaci skupiny aminoglykosidových veterinárních léků v mléce bez použití HFBA. Kombinace EDTA‑založené extrakce, RPLC kolony SB‑AQ, MRM detekce a kalibrace spike‑před‑extrakcí zajišťuje spolehlivé výsledky s LOQ vhodnými pro rutinní kontrolu reziduí. Metoda snižuje riziko kontaminace systému, zvyšuje dobu provozu přístroje a je vhodná pro implementaci v QC/QA laboratořích a sledování bezpečnosti potravin.

Reference

1. Zhai A. Aminoglycosides in Milk using Agilent Bond Elute Plexa SPE, Agilent Poroshell 120, and LC/Tandem MS. Agilent Technologies application note, publication number 5991-1758 EN, 2013.