Quantitation of Aminoglycosides group of veterinary drugs in milk samples usingLC-MS/MS without ion pairing agents in the mobile phase

Význam tématu

Aminoglykosidová antibiotika jsou v chovech hospodářských zvířat běžně používána pro léčbu infekcí a zlepšení produkčních parametrů. Jejich rezidua v mléce představují riziko pro veřejné zdraví a musí být spolehlivě monitorována v souladu s regulačními limity (řádově desítky až stovky ppb). Metody LC–MS/MS jsou preferované pro jejich citlivost a specifičnost, avšak tradiční použití iontově-párovacích činidel (např. HFBA) zvyšuje riziko potlačení signálu, kontaminace a snižuje kompatibilitu s MS. Studie představuje protokol bez HFBA, s MS-friendly mobilní fází, optimalizovanou extrakcí a kalibrací v matrixu pro robustní kvantifikaci aminoglykosidů v mléce.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyvinout reprodukovatelnou, citlivou LC–MS/MS metodu pro skupinu veterinárních aminoglykosidů v mléčných vzorcích bez použití iontově-párovacích činidel. Přístup kombinuje optimalizovanou extrakci s EDTA, MS-kompatibilní mobilní fázi obsahující amonné soli a formiovou kyselinu, použití triple-quadrupole MRM analýzy a kalibraci v matrixu pro korekci matrice efektů.

Použitá metodika

Postup přípravy vzorku:

• 1 ml mléka smíchaný s 1 ml 0,1 M EDTA, ponechat 10 minut pro chelaci divalentních iontů.
• Extrahováno 1 ml acetonitril/voda (1:1, v/v), vzorky vortexovány 1 minutu pro precipitaci bílkovin.
• Obsah centrifugován při 9000 rpm a filtrován přes nylonový filtr před injekcí.

Chromatografické podmínky:

• Mobilní fáze A: voda s 4,5 mM amonnou formiátem, 0,5 mM amonným fluoridem a 0,1 % formiovou kyselinou.
• Mobilní fáze B: acetonitril s 0,1 % formiovou kyselinou.
• Gradient: %B 0 min 10 %, 1 min 10 %, 5 min 60 %, 10 min 90 %, 12 min 90 % (celková doba ~12 min).
• Kolona: Poroshell SB AQ 150 × 4,6 mm, 2,7 μm.

Analytická detekce:

• LC–MS/MS na triple quadrupole se záznamem metodou MRM.
• Ionizace ESI v pozitivním režimu.

Kalibrace a kvantifikace:

• Pro sedm analyzovaných látek byla lineární odezva v rozmezí 2–100 ng/mL (1/x vážená regresní analýza).
• Pro Kanamycin, Spectinomycin a Apramycin byly použity rozsahy 25–300 ng/mL.
• Vzhledem k významným matrice efektům byla použita kalibrace v matrixu (pre-spike) a ověřeny recovery 80–120 %.

Praktické doporučení ke standardům:

• Apramycin a Neomycin rozpouštět ve vodě a skladovat v plastových nádobách, aby se předešlo ztrátám adsorpcí na skle.

Použitá instrumentace

• UHPLC: Agilent 1290 Infinity III.
• MS: Agilent 6475A LC/TQ (triple quadrupole), ESI pozitivní, MRM režim.

Hlavní výsledky a diskuse

• Eliminace HFBA byla úspěšná — dosaženo dobré retence a separace bez iontově-párovacího činidla díky kombinaci amonné formiátu a amonného fluoridu ve vodné fázi a vhodnému gradientu na polární C18-like kolóně (SB AQ).
• Přidání EDTA do extrakce významně zlepšilo recoveries chelací Ca2+ a dalších dvoucenných kovů, které by jinak vytvářely komplexy s aminoglykosidy a snižovaly extrakční výtěžnost.
• Matrice efekty byly pozorovatelné a rozdílně ovlivňovaly jednotlivé analyty; proto byla kalibrace v matrixu nezbytná k dosažení přesnosti a opakovatelnosti (recoveries 80–120 %).
• Některé sloučeniny vyžadovaly vyšší rozsah kalibrace (25–300 ng/mL), což poukazuje na rozdílnou citlivost a přítomnost vysokých koncentrací v některých vzorcích.
• Mravenec: zachování konstantních MRM ionových poměrů potvrdilo selektivitu metody a robustnost kvantifikačních signálů.

Přínosy a praktické využití metody

• Metoda nabízí rychlý a přenosný workflow pro rutinní screening a kvantifikaci aminoglykosidů v mléce bez nutnosti iontově-párovacích činidel, čímž zvyšuje kompatibilitu a životnost MS přístrojů a snižuje riziko ion-suppression.
• Simplifikovaná příprava vzorku (EDTA + acetonitril/woda) je vhodná pro vysoký průtok vzorků a laboratorní rutinu.
• Aplikovatelné pro kontrolu dodržování regulačních limitů a interní QA/QC v potravinářských laboratořích; metoda pokrývá obecné koncentrace reziduí (od ~2 ng/mL do stovek ng/mL podle látky).

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další rozšíření panelu analyzovaných aminoglykosidů a validace napříč různými mléčnými matrixy (plnotučné, odtučněné, sýřenky) pro zvýšení obecnosti metody.
• Integrace interních standardů s 13C/15N značením pro snížení variací způsobených maticí a zlepšení kvantifikace na nízkých úrovních.
• Využití polymorfních kolonn a alternativních mobilních fází (optimalizace pH/iontové síly) pro další zlepšení separace podobných aminoglykosidů bez iontově-párovacích činidel.
• Automatizace přípravy vzorků a nasazení v monitorovacích sítích pro rychlé reakce na regulační požadavky a masivní skríning.

Závěr

Vyvinutá LC–MS/MS metoda poskytuje robustní, citlivé a MS-kompatibilní řešení pro analýzu aminoglykosidů v mléce bez použití HFBA. Klíčové prvky úspěchu zahrnují použití EDTA při extrakci, mobilní fázi s amonnými modifikátory a kalibraci v matrixu k potlačení efektů matrice. Metoda je vhodná pro rutinní kontrolu reziduí a splňuje požadavky na přesnost, senzitivitu a průběžnou reprodukovatelnost v laboratorních podmínkách.

Reference

• Agilent Application note, 5991-1758 EN, Aminoglycosides in Milk using Agilent Bond Elute Plexa SPE, Agilent Poroshell 120, and LC/Tandem MS.