Characterization of Endogenous Ligands in Membrane Proteins Using Dynamic Field Declustering (DFD) on the Cyclic™ IMS P20 Mass Spectrometer

Význam tématu

Membránové proteiny představují zásadní skupinu biologických cílů (až ~60 % schválených terapeutických cílů) a jejich charakterizace je klíčová pro farmaceutický vývoj i základní biomedicínský výzkum. Analýza těchto proteinů v nativním stavu pomocí hmotnostní spektrometrie je však komplikovaná nutností použití detergentů či membránových mimetik, které při ionizaci vytvářejí addukty a micely zkreslující měření přesné hmotnosti. Metody, které dokážou spolehlivě odstranit solubilizační prostředí v plynné fázi a zároveň zachovat ne-kovalentní ligandové interakce, zvyšují důvěru v identifikaci endogenních vazebných partnerů a rozšiřují možnosti studia protein–ligand komplexů přímo z biologických matric.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikovaného popisu bylo demonstrovat nasazení technologie Dynamic Field Declustering (DFD) implementované v Cyclic IMS P20 mass spektrometru pro: odstraňování detergentních micel z ionizovaných membránových proteinů, odhalení „naked“ proteinových signálů a umožnění vysoce jisté identifikace endogenně vázaných lipidů. Jako model posloužil bacteriorhodopsin (bR) izolovaný v purple membrane; studie rovněž ukázala workflow pseudo‑MS4 (uvolnění z micely → kvadrupólová izolace → uvolnění ligandu → ion mobility separace → post‑IMS CID) pro strukturální potvrzení vázaných lipidů.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Příprava: bR v purple membrane suspendovaný v 40 mM β‑D‑glucopyranoside (2× CMC) a 200 mM ammonium acetate; centrifugace a rychlá výměna pufru přes gel-filtrační columnu; koncentrace 1–5 µM monomeru.
• Ionizace: nanoESI z borosilikátových kapilár se statickým nanospray adaptérem.
• DFD: kontinuální aktivace v oscilujícím RF poli umístěném v StepWave ion guidu pro postupné „declustrovaní“ a odstranění detergentních aduktů před kvadrupólem.
• Pseudo‑MS4 workflow: (1) DFD uvolní protein z micely, (2) kvadrupól izoluje vybraný nabitý stav komplexu, (3) trap CID uvolní ligand, (4) Cyclic ion mobility oddělí ligand od bílkovinných iontů a (5) transfer CID poskytne časově zarovnané fragmenty ligandu pro strukturální identifikaci.

Použitá instrumentace

• Hmotnostní spektrometr: Waters Cyclic IMS P20 Mass Spectrometer.
• Umístění DFD: StepWave ion guide integrovaný do vstupu, umožňující declustering před kvadrupólem.
• Klíčové provozní parametry (vybrané): režim Sensitivity, m/z 50–8000, pozitivní polarity, cone 50 V, zdroj 100 °C, capillary 1.2 kV, DFD 60 kHz/175 Vpp, trap CID 100 V (pseudo‑MS4), transfer CID 30 V, Single Pass ion mobility s T‑wave amplitude 22 V.

Hlavní výsledky a diskuse

• Aktivace DFD zásadně zlepšila detekci proteinových signálů: bez DFD byl spektrum dominován detergentními klustry; s DFD se objevily dobře definované proteiny a aduktované formy.
• Deconvoluce (BayesSpray) uvedla hmotnost bR 27049.9 Da s chybou ~4 ppm vůči sekvenční hmotnosti, což potvrzuje přesnost měření po odstranění micely.
• Byly detekovány formy bR s vázanými lipidy: postupné přírůstky o +901 Da identifikované jako kopie archeálního lipidu PGP‑ME (až tři vazby) a přírůstky +1220 Da odpovídající lipidům S‑TGA‑1; rovněž se objevily smíšené komplexy (např. 1:1:1 a 1:2:1 poměry).
• Pseudo‑MS4 analýza: izolace [bR+PGP‑ME]9+ následovaná trap CID vedla k uvolnění lipidu; následná ion mobility separace oddělila nízkomolekulární ionty od proteinu a post‑IMS CID vytvořilo časově zarovnané fragmenty ligandu.
• Analýza fragmentů umožnila strukturální potvrzení PGP‑ME: volný lipid při m/z 901.6 a fragmenty charakteristické pro hlavičkovou skupinu (m/z ~249), identické mastné kyselinové řetězce (m/z ~337–357) a další alkyl/řetězcové fragmenty. Ion mobility dimenze pomohla odstranit rušivé signály, které se jevily na jiných arrival times.

Přínosy a praktické využití metody

• DFD umožňuje kompletní odstranění detergentních micel za podmínek, které zachovávají ne‑kovalentní ligandové interakce — klíčové pro autentickou identifikaci endogenních vazebníků.
• Možnost provádět pseudo‑MS4 (uvolnění → izolace → separace → fragmentace) poskytuje citlivé a selektivní nástroje pro potvrzení identity ligandů na úrovni fragmentů, což zvyšuje důvěru při analyzování komplexních biologických vzorků.
• Aplikace v průmyslové praxi: screening vazeb malých molekul, identifikace lipidů nebo jiných endogenních ligandů pro membrane‑target proteiny (např. GPCR), a rozšíření nativních přístupů do proteomiky a farmakologie.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření aplikací na širší spektrum membránových proteinů včetně GPCRs, iontových kanálů a komplexních multisubunitních systémů přímo z buněčných nebo tkáňových extraktů.
• Vylepšení řízení DFD (ladění frekvence/amplitude) pro jemnější balans mezi účinným declusteringem a zachováním slabých ne‑kovalentních interakcí.
• Integrace vyššího počtu IMS průchodů a pokročilých časově‑zarovnaných top‑down fragmentačních režimů pro mapování polohy ligandů na proteinových plochách.
• Automatizace pseudo‑MSn workflow a zlepšení softwaru pro dekonvoluci, zarovnání IMS fragmentů a interpretaci lipidových struktur přímo v rámci platformy pro vyšší propustnost analýz.
• Synergie s „omics“ přístupy (lipidomika, proteomika) pro holistické mapování endogenních interakcí membránových proteinů v kontextu buněčných funkcí a farmakologie.

Závěr

Kombinace Dynamic Field Declustering (DFD) integrovaného v StepWave a cyklické ion mobility na Cyclic IMS P20 poskytuje efektivní a citlivé workflow pro analýzu membránových proteinů v jejich nativním stavu. DFD odstraní rušivé detergentní micely a umožní přesné měření hmotnosti proteinu, zatímco pseudo‑MS4 přístup přináší fragmentační data potřebná pro strukturační potvrzení endogenních ligandů. Tato kombinace výrazně zvyšuje jistotu při identifikaci lipidových vazebníků a rozšiřuje analytické možnosti nativní hmotnostní spektrometrie v aplikacích od výzkumu až po screening v průmyslu.

Reference

1. Fiorentino F., Rotili D., Mai A. Native mass spectrometry‑directed drug discovery: Recent advances in investigating protein function and modulation. Drug Discov Today. 2023;28:103548.
2. Hopper J.T.S. Mass Spectrometry: Application to Protein‑Ligand Interactions. In: Encyclopedia of Biophysics. 2021:1–7.
3. El‑Hawiet A., Shoemaker G.K., Daneshfar R., Kitova E.N., Klassen J.S. Applications of a Catch and Release Electrospray Ionization Mass Spectrometry Assay for Carbohydrate Library Screening. Anal Chem. 2011;84:50–58.
4. Gault J., et al. Combining native and ‘omics’ mass spectrometry to identify endogenous ligands bound to membrane proteins. Nat Methods. 2020;17:505–508.
5. Errey J.C., Fiez‑Vandal C. Production of membrane proteins in industry: The example of GPCRs. Protein Expr Purif. 2020;169:105569.
6. Sokratous K., et al. Enhanced Declustering Enables Native Top‑Down Analysis of Membrane Protein Complexes using Ion‑Mobility Time‑Aligned Fragmentation. J Am Soc Mass Spectrom. 2024;35:1891–1901.
7. Le J., Loo J.A. Native Top‑Down Mass Spectrometry Characterization of Model Integral Membrane Protein Bacteriorhodopsin. J Am Soc Mass Spectrom. 2025;36:961–968.