DEVELOPMENT OF A MODIFIED CYCLIC IMS PLATFORM FOR ENHANCED BIOMOLECULE CHARACTERIZATION

Význam tématu

Ionová mobilitní hmotnostní spektrometrie (cIMS-MS) se stala klíčovou technologií pro charakterizaci velkých biomolekul díky schopnosti zachovat natívní konformace, provádět elektronově podpořené štěpení (ECD), povrchové indukované disociace (SID) a vysoce citlivé bottom-up i intact analýzy. Zlepšení citlivosti, selektivity a odstraňování nespecifických aduktů přímo zvyšuje informační hodnotu spekter a umožňuje detailnější strukturální a sekvenční analýzy protéinů, komplexů a peptidů. Vývoj hardwarových a softwarových úprav, jako jsou Wideband Enhancement (WBE) a Dynamic Field Declustering (DFD), umožňuje rozšířit aplikační dosah cIMS přístrojů pro moderní bioanalytiku.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem popsaného vývoje bylo zvýšit citlivost a kvalitu dat cIMS-MS pro analýzu biomolekul pomocí dvou hlavních modifikací: 1) Wideband Enhancement — synchronizované řízení pusheru a gatingu k selektivnímu zvýšení duty cycle přes široké m/z a driftové rozmezí; 2) Dynamic Field Declustering — upravená StepWave ion guide se sekcí pro aktivní declustering za účelem lepší desolvace a odstranění aduktů. Dále byla zjednodušena tvorba CIU metod, aby bylo možné rychle generovat CIU datové sady. Studie ukazuje efekt těchto modifikací na modelových systémech (streptavidin, lysozym, ubiquitin, [glu]-fibrinopeptide B, NIST mAb) a demonstruje aplikace v tandem-MS a šetrné natívní analýze.

Použitá metodika a instrumentace

Popisovaná instrumentace a konfigurace:

• Cyclic IMS P20 Mass Spectrometer (Waters) s horní m/z hranicí přes 100 000 a volitelným vysokomassovým kvadrupolem do m/z ~32 000.
• Modifikovaná StepWave Ion Guide s declustering regionem: dvě paralelní deskové elektrody nad a pod ionovým paprskem a řada kruhových elektrod po stranách.
• Pre-IMS ECD buňka pro elektronovou fragmentaci před separací v IMS; kompatibilita s dalšími pre-IMS technikami (CID, SID).
• Wideband Enhancement (WBE): softwarová funkce využívající uživatelskou lookup tabulku definující počáteční a koncové m/z a odpovídající drift časy; synchronizace pusheru s gatingem při výstupu z IMS pro zvýšení duty cycle vybraných iontů.
• Dynamic Field Declustering (DFD): aplikace laditelného čtvercového RF napětí mezi deskami v declustering regionu, která vyvolává oscilace iontů, prodlužuje jejich dráhu a zvyšuje počet kolizí pro lepší desolvaci a odstranění nespecifických aduktů.
• Softwareové rozšíření pro CIU: generátor funkcí pro automatické sestavení kolizních napěťových ramp (start, krok, doba kroku, počet kroků) a automatické vytvoření akviziční tabulky.

Hlavní výsledky a diskuse

Klíčové experimentální poznatky a interpretace:

• Wideband Enhancement (WBE) zvýšilo signál až přibližně 10násobně pro definované oblasti m/z–drift prostoru. To bylo demonstrováno na modelových fragmentech ([glu]-fibrinopeptide B), ECD fragmentech ubiquitinu (zvýšení intenzit c- a z-iontů) a CID fragmentech lysozymu, kde byla možné v rámci jediné akvizice posílit různé populační regiony fragmentů (např. +1 vs +2/+3).
• WBE funguje skrze uživatelsky nastavitelné lookup tabulky, což umožňuje selektivní posílení různých oblastí dat bez kompromisu resolution IMS; je kompatibilní se všemi HD režimy a pre-IMS fragmentacemi. Omezení je nutnost přesného nastavení start/stop parametrů a potenciální bias směrem k preferovaným oblastem spektra.
• Dynamic Field Declustering (DFD) prokázalo výrazné zlepšení v odstranění nespecifických aduktů a zlepšení „čistoty“ natívních spekter. Na příkladu streptavidinu vedlo zvýšení declustering potenciálu ke krokovému odstranění aduktů a zlepšení rozlišení, přičemž při nejvyšších potencích došlo i k disociaci tetrameru (možnost pseudo-MS3 při kombinaci s downstream fragmentací).
• DFD funguje zároveň jako mobilitní nízkoprůchodní filtr: ionty s nízkou mobilitou oscilují a narážejí na desky, čímž se redukuje přenos nestabilních/velmi solvovaných iontů. To má výhodu v odstranění matice, ale vyžaduje pečlivé nastavení při analýze labile konformací.
• Nový CIU workflow zrychluje generování CIU fingerprintů díky automatizovanému sestavení akvizičních funkcí; bylo ukázáno na NIST mAb (+26) s následnou analýzou pomocí CIUSuite2.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické přínosy implementovaných úprav:

• Výrazné zlepšení citlivosti pro tandem MS analýzy velkých biomolekul, umožňující detekci slabších fragmentů a zlepšení sekvenční pokrytí, zejména pro nízkou účinnost ECD.
• Možnost selektivní akcelerace signálu v definovaných m/z–drift oblastech bez ztráty IMS rozlišení — užitečné pro komplexní směsi a cílené MS/MS metody.
• DFD poskytuje účinný způsob, jak redukovat non-specifické addukty a zlepšit interpretovatelnost natívních spekter, což usnadňuje identifikaci heterogenity (např. různé N-terminální varianty) a zvyšuje efektivní rozlišovací schopnost.
• Automatizované CIU metody zkracují čas potřebný k vytvoření experimentů a podporují širší nasazení CIU v rutinních pracovních postupech (stability, konformační analýza mAb apod.).

Budoucí trendy a možnosti využití

Možné směry dalšího rozvoje a aplikace:

• Integrace adaptivního WBE: dynamické nastavování enhancement regionů v reálném čase na základě předběžného průzkumu spektra (možnost využití strojového učení pro automatické identifikování oblastí požadujících zvýšení citlivosti).
• Prohloubení pseudo-MS3 workflow: záměrné využití DFD k řízené disociaci komplexů následované cílenou fragmentací (CID/ECD/SID) a sekvenováním velkých podjednotek.
• Rozšíření do top‑down a intact proteomiky: lepší desolvace a citlivost usnadní analýzu velkých proteoform a heterogenních komplexů, včetně virových částic a velkých assemblů.
• Zlepšení tvaryvého a vlnového řízení v DFD: vývoj optimálních forem RF polí pro maximální odvádění aduktů při zachování konformace natívních komplexů.
• Automatizované CIU a integrace s pokročilými softwarovými nástroji pro rychlé vyhodnocení konformačních změn v biopharmaceutické kontrole kvality.

Závěr

Modifikace cIMS platformy popsané v práci — Wideband Enhancement a Dynamic Field Declustering — představují praktická a významná vylepšení pro analýzu velkých biomolekul. WBE nabízí cílené zvýšení citlivosti v m/z–drift prostoru až o řád, a DFD efektivně čistí natívní spektra od aduktů a zlepšuje desolvaci. Spolu s vylepšeným CIU workflow tvoří tyto inovace silný nástroj pro detailní strukturální a sekvenční charakterizaci proteinů, komplexů a dalších biologických makromolekul. Optimální využití vyžaduje pečlivé doladění parametrů kvůli kompromisu mezi odstraňováním aduktů a zachováním citlivých natívních interakcí.

Reference

• McCullough BJ, Cooper-Shepherd DA, Hewitt D, Harker D, Marsden-Edwards E. Development of a modified cyclic IMS platform for enhanced biomolecule characterization. Waters Corporation poster, 2026.
• Waters Corporation. White paper WP660 (uváděné výsledky ECD a WBE v dokumentaci výrobce).