Developing a declustering ion guide and Cyclic IMS-enabled Wideband Enhancement for native top-down studies

Význam tématu

Native top-down analýza proteinů poskytuje detailní pohled na proteoformy v jejich biologickém kontextu, což je klíčové pro pochopení variability posttranslačních modifikací, interakcí s lipidovými prostředími a pro kvalitativní i kvantitativní farmaceutické aplikace. Praktickými omezeními jsou neúplná desolvatace iontů způsobená matricemi, solemi a detergenty a nízká citlivost při analýze slabě zastoupených nebo velkých oligomerů. Metody, které zlepší declustering a zvýší využitelnost iontů v TOF režimech, mají přímý dopad na schopnost získat vysoce kvalitní tandemové spektra pro top-down sekvenování nativních komplexů.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo vyvinout a demonstrovat použití declustering ion guide (Dynamic Field Declustering, DFD) ve spojení s Cyclic IMS a režimem Wideband Enhancement (WBE) pro zlepšení rozlišení a citlivosti při nativních top-down studiích. Hlavní body studie:

• Optimalizace DFD pro zlepšení desolvace a redukci aduktů na modelovém NISTmAb.
• Ukázání schopnosti DFD částečně disociovat oligomerní komplexy (příklad streptavidinu) a umožnit pseudo-MS3 workflow.
• Demonstrace uvolnění membránového proteinu bacteriorhodopsinu z detergentového micelu a detekce vázaných lipidů.
• Nasazení WBE ke zvýšení duty cycle v TOF režimu a tím ke zlepšení citlivosti pro top-down fragmentaci.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky a příprava:

• NISTmAb (standard), streptavidin a bacteriorhodopsin (bR).
• Všechny vzorky byly nativně ionizovány v 200 mM amonného acetátu pomocí nESI kapilár s vnitřním průměrem 2 µm.
• Pro bR byla použita resuspendace a výměna pufru do 40 mM β-D-glukopyranosidu (OG) v 200 mM amonném acetátu pro udržení proteinu v detergentovém micelu.

Instrumentace:

• Waters Cyclic IMS P20 Mass Spectrometer pracující v pozitivním nESI režimu.
• Dynamic Field Declustering (DFD) zařízení umístěné v pre-IMS oblasti sloužící k aktivnímu declusteringu a předaktivaci iontů.
• Wideband Enhancement (WBE) režim pro synchronizaci uvolňování iontových paketů s TOF pusherem.
• Softwarové nástroje: MassLynx v4.2 pro akvizici a waters_connect/UNIFI pro top-down zpracování dat.

Metodické poznámky:

• Parametry DFD (frekvence 60 kHz, amplitudy 0–280 Vpp) byly systematicky zkoumány na NISTmAb pro optimalizaci desolvace a rozlišení glykoform.
• Pseudo-MS3 workflow zahrnoval částečnou disociaci oligomeru pomocí DFD, selekci monomeru kvadrupolem a následnou CID fragmentaci s WBE nasazeným pro zvýšenou citlivost.

Hlavní výsledky a diskuse

Declustering (DFD):

• Zvýšení amplitudy DFD od 0 do 280 Vpp při 60 kHz zlepšilo desolvaci NISTmAb, snížilo adukty a zlepšilo zjevné rozlišení glykoform. To ukazuje, že DFD může efektivně declustrovat nativní vzorky bez náročného doladění.
• Pro streptavidin byla optimální amplituda ~175 Vpp, která vedla k vylepšenému zobrazení Met-clip variant a částečné disociaci tetrameru na monomerní formy (uvolnění monomeru 7+), čímž byla umožněna selektivní top-down analýza.

Wideband Enhancement (WBE):

• WBE synchronizuje uvolňování iontových paketů z IMS se stiskem TOF pusheru, čímž významně zvyšuje duty cycle a efektivní přenos iontů v rozsáhlém m/z pásmu.
• Využití WBE při pseudo-MS3 fragmentaci monomeru streptavidinu vedlo k vysoce kvalitnímu spektru s pokrytím sekvence 78,7 %.

Membránový protein (bacteriorhodopsin):

• DFD umožnil uvolnění monomerického bR z OG micelu a odhalení isotopicky rozlišených iontových signálů (např. 9+), které byly skryty v přítomnosti detergentu.
• Dekonvoluovaná spektra prokázala přítomnost lipid-vázaných forem bR; identifikovány byly archeální lipidy relevantní pro fialovou membránu (např. PGP-Me a S-TGA-1).

Diskuse:

• Kombinace DFD a WBE překonává dvě hlavní překážky nativní top-down MS: aduktovou heterogenitu a nízkou TOF efektivitu přenosu. To umožňuje získat sekvenční informace přímo z nativních komplexů a membránových proteinů.
• Výsledky ukazují, že aktivní předaktivace (DFD) může fungovat jako efektivní krok „declustrující“ bez poškození strukturálních rysů kritických pro nativní analýzu, přičemž WBE kompenzuje ztráty citlivosti typické pro TOF režimy.

Přínosy a praktické využití metody

Hlavní přínosy:

• Zvýšené rozlišení a menší množství aduktů u nativních proteinů a komplexů zlepší identifikaci proteoform a glykoform.
• Možnost provést pseudo-MS3 top-down workflows přímo z nativních komplexů usnadní lokalizaci modifikací a variant v rámci oligomerů.
• Uvolnění membránových proteinů z detergentových micel umožní studium lipidových vazeb a jejich charakterizaci pomocí nativní MS.

Praktické aplikace:

• Farmaceutický výzkum (analýza monoklonálních protilátek a jejich glykozylace), kvalita bioprodukce a kontroly stability proteinních komplexů.
• Studium interakcí membránových proteinů s lipidy a charakterizace proteoform v nativním prostředí.
• Analytika nízce zastoupených proteoform díky zvýšené citlivosti WBE.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozvoj a integrace:

• Další vylepšení DFD parametrů a automatizované optimalizace pro různé třídy proteinů (solubilní vs. membránové) k minimalizaci experimentálního doladění.
• Rozšíření WBE principu a jeho kombinace s jinými detektory/fragmentačními technikami pro širší m/z pokrytí a vyšší sekvenační hloubku.
• Vývoj vzorkových postupů podporujících detekci vyšších oligomerů (např. trimerů bR) v nativním stavu, včetně jemných detergentních strategií a stabilizačních prostředků.
• Aplikace na kvantitativní nativní analýzy a rutinní laboratorní workflow v QA/QC prostředí.

Potenciální omezení a oblasti pro další výzkum:

• Závislost na optimalizaci DFD pro různé proteiny, riziko nežádoucí aktivace nebo částečné unfoldingu při příliš intenzivním declusteringu.
• Nutnost ověření přenositelnosti mezi platformami a studií vlivu na biologicky relevantní nekovalentní interakce.

Závěr

Kombinace Dynamic Field Declustering a Wideband Enhancement v rámci Cyclic IMS přináší efektivní a relativně jednoduchý přístup ke zlepšení nativních top-down analýz. DFD významně redukuje adukty a uvolňuje membránové proteiny z detergentů, zatímco WBE podstatně zvyšuje citlivost TOF analýz synchronizací iontových paketů. Společně tyto technologie umožňují získat vysokou sekvenační pokrytí přímo z nativních komplexů a otevírají cestu k robustnějším pseudo-MS3 pracovním postupům a detailnímu studiu protein–lipid interakcí.

Reference

1. Cheng D, Guo Y, Lyu J, et al. Advances and challenges in preparing membrane proteins for native mass spectrometry. Biotechnology Advances. 2025;78:108483.
2. Tamara S, den Boer MA, Heck AJR. High-Resolution Native Mass Spectrometry. Chem Rev. 2022;122(8):7269-7326.
3. Hoang C, Uritboonthai W, Hoang L, et al. Tandem Mass Spectrometry across Platforms. Anal Chem. 2024;96(14):5478-5488.
4. Inada M, Kinoshita M, Matsumori N. Archaeal Glycolipid S-TGA-1 Is Crucial for Trimer Formation and Photocycle Activity of Bacteriorhodopsin. ACS Chem Biol. 2020;15(1):197-204.