LC/MS dMRM Method Refinement Expands Targeted Lipidomics Studies from Plasma to Cells and Tissues

Význam tématu

Lipidové molekuly jsou základní součástí buněčných membrán a hrají klíčovou roli v buněčné signalizaci, energetickém metabolismu a neurobiologii.
Detailní mapování lipidového profilu (lipidomu) umožňuje porozumět změnám ve zdravotním a chorobném stavu organismu a podpořit vývoj biomarkerů.
Rozšíření cílených metod LC/MS/MS z plazmy na buněčné a tkáňové vzorky pomáhá odhalit širší spektrum lipidových druhů, včetně izomerických a izobarických forem, které jsou v tkáních, zejména v mozku, významně zastoupené.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo upravit stávající LC/MS/MS metodiku pro analýzu plazmového lipidomu tak, aby pokryla více než 1 300 molekulových druhů lipidů v mozkové tkáni.
Primárním přístupem bylo prodloužení chromatografické gradienty, optimalizace dMRM přechodů a zavedení strategií eliminace izotopických a izobarických interferencí.
Metoda byla navržena tak, aby zachovala vysokou citlivost, přesnost a reprodukovatelnost při analýze komplexních biologických vzorků.

Použitá instrumentace

Analytickou chromatografii zajišťoval Agilent 1290 Infinity II/III LC systém s C18 kolonkou (100 × 2,1 mm, 1,8 µm).
Ionizaci a detekci prováděl trojitý kvadrupól Agilent 6495C LC/TQ se zdrojem Jet Stream. Pro strukturální anotace byla využita vysokorozlišovací LC/Q-TOF (Q-RAI) od Agilent.

Hlavní výsledky a diskuse

Rozšířením chromatografického běhu na 20 minut se podařilo výrazně zlepšit separaci a pokrytí glycerofosfolipidů a sfingolipidů v mozkové tkáni.
dMRM metoda zahrnovala 940 přechodů, které monitorovaly více než 1 300 molekulových druhů napříč 53 lipidovými třídami.
Uplatněné strategie pro eliminaci izotopických interferencí a rozlišení izomerů (např. overlay přechodů se složenou hmotností, kyselinová hydrolýza plasmalogenů) zvýšily specifitu integrace píků.
Strukturální charakterizace acylových řetězců byla podpořena post-column přidáváním alkalických aditiv (Na+, Li+) a datově-nezávislým akvizicím Q-TOF.

Přínosy a praktické využití metody

• Komplexní pokrytí lipidomu mozkové tkáně i dalších buněčných typů.
• Vysoká reprodukovatelnost a robustnost díky dMRM režimu a kvalitativním kontrolám (PQC, TQC, blank vzorky).
• Možnost paralelního sledování izomerických a izobarických lipidů.
• Přenositelnost metody mezi laboratořemi a platformami (6495C/D, 1290 II/III).

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj může zahrnovat rozšíření počtu přechodů na platformách s vyšší kapacitou cyklů (Agilent 6495D) a adaptaci na buňky a tkáně s odlišnou lipidovou kompozicí.
Implementace dovětků strojového učení pro predikci retenčních časů a automatizaci kalibrace dMRM oken.
Integrace metod s vyšším rozlišením (ion mobility, SWATH/DIA) pro detailnější strukturální analýzu lipidů.

Závěr

Prodloužená chromatografie spojená s rozšířeným dMRM přechodovým seznamem umožňuje cílenou lipidomickou analýzu mozkové tkáně s více než 1 300 molekulovými druhy.
Navržené postupy pro eliminaci izotopických a izobarických interferencí a rozsáhlé využití interních standardů zajistily vysokou specifitu a reprodukovatelnost dat.
Metoda je snadno přenositelná a slibuje další rozšíření nasazení v buněčné a tkáňové lipidomice.

Reference

• Huynh K. a kol. A Comprehensive, Curated, High-Throughput Method for the Detailed Analysis of the Plasma Lipidome. Agilent Technologies application note 5994-3747EN, 2021.
• Huynh K. a kol. High-Throughput Plasma Lipidomics: Detailed Mapping of the Associations with Cardiometabolic Risk Factors. Cell Chemical Biology 2019, 26(1):71–84.
• Sartain M. a kol. An Interlaboratory Evaluation of a Targeted Lipidomics Method in Plasma. Agilent Technologies application note 5994-6830EN, 2024.
• Alshehry Z.H. a kol. An Efficient Single Phase Method for the Extraction of Plasma Lipids. Metabolites 2015, 5(2):389–403.
• Folch J., Lees M., Stanley G.H.S. A Simple Method for the Isolation and Purification of Total Lipides from Animal Tissues. Journal of Biological Chemistry 1957, 226(1):497–509.
• Matyash V. a kol. Lipid Extraction by Methyl-Tert-Butyl Ether for High-Throughput Lipidomics. Journal of Lipid Research 2008, 49(5):1137–1146.
• Bligh E.G., Dyer W.J. A Rapid Method of Total Lipid Extraction and Purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology 1959, 37(8):911–917.
• Hsu F.-F., Turk J. Electrospray Ionization/Tandem Quadrupole Mass Spectrometric Studies on Phosphatidylcholines: the Fragmentation Processes. Journal of the American Society for Mass Spectrometry 2003, 14(4):352–363.
• Hsu F.-F., Turk J. Characterization of Phosphatidylinositol, Phosphatidylinositol-4-Phosphate, and Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphate by Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry: a Mechanistic Study. Journal of the American Society for Mass Spectrometry 2000, 11(11):986–999.
• Hsu F.-F., Turk J. Structural Determination of Sphingomyelin by Tandem Mass Spectrometry with Electrospray Ionization. Journal of the American Society for Mass Spectrometry 2000, 11(5):437–449.
• Weir J.M. a kol. Plasma Lipid Profiling in a Large Population-Based Cohort. Journal of Lipid Research 2013, 54(10):2898–2908.