Quantification of Mycotoxins in Food Matrices

Význam tématu

Mykotoxiny jsou toxické sekundární metabolity plísní, které se běžně vyskytují v obilovinách, semenech, sušeném ovoci, ořeších a zpracovaných potravinách. Jejich přítomnost představuje zdravotní riziko (karcinogenní, mutagenní, neurotoxické účinky) a proto jsou v EU stanoveny přísné limity. Rychlé, citlivé a robustní analytické metody schopné pracovat s komplexními matricemi bez nákladných a časově náročných čisticích kroků (SPE, IAC) mají v praxi velký význam pro kontrolu kvality potravin a bezpečnost spotřebitelů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace bylo demonstrovat proveditelnost a přínos dvoudimenzionální kapalinové chromatografie (2D-LC) v kombinaci s triple kvadrupólem (6495D TQ) pro kvantifikaci pěti mykotoxinů — aflatoxinů B1, B2, G1, G2 a ochratoxinu A — v typických potravinářských matricích (pasta, hnědá rýže, kajenské koření). Studie testovala přímou analýzu jednoduše extrahovaných vzorků bez použití SPE/IAC, hodnotila linearitu, limity kvantifikace, návratnost a opakovatelnost a ukázala integrované řízení celého 2D-LC workflow v jednom softwarovém prostředí.

Použitá metodika

Postup vzorkování a extrakce:

• 5 g homogenizovaného materiálu extrahováno směsí acetonitril/voda, protřepáno a odstředěno.
• Extrakt byl naředěn tak, aby konečný poměr organické fáze/vody byl přibližně 26/74 (v/v) před injekcí.

Kalibrace a interní standardy:

• Křivky připraveny v rozsahu 0,01–5 ng/mL (10 hladin) v 20/80 acetonitril/voda.
• Použity izotopově značené interní standardy pro všech pět analytů pro korekci matrix efektů a kvantifikaci.

2D-LC režim a parametrizace:

• Režim multiple heart-cutting: z první dimenze byly časově vyřezány pětice „cutů“ odpovídajících analyzovaným mykotoxinům do 40 µL smyček, které se následně analyzovaly na 2. dimenzi.
• Celkový čas injekce (1. + 2. dimenze) 14 minut; každý cut v 2. dimenzi ~1,75 minuty včetně backwash a equilibration.
• Analytické objemy: injekce 3 µL, vzorková teplota 6 °C, 1D průtok ~400 µL/min, 2D průtok ~500 µL/min.
• Gradienty a modulační strategie (Active Solvent Modulation) použity k minimalizaci ředění a zajištění kompatibility mezi dimenzemi.

Hmotnostní detekce:

• Agilent 6495D Triple Quadrupole s Agilent Jet Stream ESI v kladném módu, režim MRM s optimalizovanými přechody pro každý analyzát.
• Konstantní fragmentor ~166 V, dwell ~30 ms na přechod; použití iFunnel režimů pro lepší citlivost a selektivitu.
• Data akvizice a řízení 2D-LC probíhalo v MassHunter Acquisition (rev. 12.x) s následným zpracováním v MassHunter Quantitative for QQQ.

Použitá instrumentace

Hlavní vybavení použité ve studii:

• Agilent 1290 Infinity II 2D-LC řešení s dvěma vysokotlakými pumpami, multisamplerem (chlazeným), vícekolonovými termostaty a sadou ventilů pro ASM a multiple heart-cutting (40 µL smyčky).
• Kolony: 1. dimenze Agilent Poroshell Phenyl Hexyl 2.1×50 mm, 2.7 µm; 2. dimenze Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 2.1×50 mm, 1.8 µm.
• Agilent 6495D Triple Quadrupole LC/MS s Jet Stream ESI zdrojem.

Hlavní výsledky a diskuse

Citlivost a linearita:

• Lineární závislost pro aflatoxiny B1, B2, G1 v rozsahu 0,01–5 ng/mL; G2 a OTA měly lineární rozsah od 0,03 ng/mL. Všechny analyty dosáhly R2 > 0,998.

Limit kvantifikace a opakovatelnost:

• Požadovaný LOQ dle EU (zvolený odpovídající nízký spike 0,08 ng/mL, tj. ~0,96 µg/kg) byl splněn pro všechny analyty a matrice.
• Pro sedm replik 0,08 ng/mL byly RSD plochy a retenčního času v rozmezí 1,89–4,53% a ≤0,07% RT RSD, což dokládá robustnost nastavení cutů a stability systému.

Návratnosti a přesnost v matricích:

• Testy nízkého (0,08 ng/mL) a vysokého (2 ng/mL) spike ukázaly návratnosti v rozmezí ~70–120% (po korekci pomocí interních standardů).
• RSD koncentrací u nízkého levelu (tři injekce) byly 0,71–8,18% pro různé analyty a matrice.

Praktický dopad 2D separace:

• 2D-LC významně snížila matrix interference a umožnila přímou analýzu naředěných extraktů bez předchozí SPE/IAC očisty, což zjednodušilo workflow a zkrátilo čas na analýzu.

Shrnutí obsahu tabulek a obrazů:

• Tabulky popisovaly chromatografické podmínky pro obě dimenze, injektovací program (včetně needle wash), parametry MS a MRM přechody; tyto informace posloužily k optimálnímu nastavení metody (ASM faktor, teploty, průtoky a časování cutů).
• Obrázky ukazovaly kalibrační křivky s vysokou linearitou a chromatogramy pro LOQ a spike vzorky ve třech matricích, demonstrující čistotu separace a dostatečnou citlivost metody.

Přínosy a praktické využití metody

• Úspora času a nákladů díky eliminaci SPE/IAC kroků, snížení spotřeby sorbentů a spotřebního materiálu.
• Vyšší průchodnost laboratoře: celkový cyklus 14 minut na injekci umožňuje zvýšenou kapacitu analýz s dobrou citlivostí.
• Robustnost a reprodukovatelnost vhodná pro rutinní sledování mykotoxinů v potravinách v souladu s legislativními požadavky EU.
• Integrované softwarové řízení zjednodušuje validaci, nastavování cutů a monitorování stavu systému.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření panelu analyzovaných toxinů a optimalizace pro multiresiduální screening širších tříd kontaminantů.
• Integrace s vysokorozlišovacími hmotnostními spektrometry pro neznámé screeningy a strukturální identifikace spolu s cílenou kvantifikací pomocí TQ.
• Automatizace přípravy vzorků a datové pipelines pro vysokou propustnost a standardizaci výsledků mezi laboratořemi.
• Možné zjednodušení legislativních postupů díky validovaným 2D-LC workflow, které poskytují spolehlivá data bez nákladných čisticích kroků.

Závěr

Studie prokázala, že 2D-LC v kombinaci s Agilent 6495D TQ je efektivní a robustní přístup pro kvantifikaci aflatoxinů a ochratoxinu A v náročných potravinových matricích. Metoda splňuje požadavky EU na LOQ, vykazuje dobré návratnosti a opakovatelnost a umožňuje přímou analýzu jednoduše extrahovaných vzorků bez SPE či IAC. Použití ASM, multiple heart-cutting a integrovaného softwaru činí řešení prakticky použitelné pro rutinní kontrolu kvality a monitorování bezpečnosti potravin.

Reference

1. European Commission. Commission Regulation (EU) 2023/915 of 25 April 2023 on maximum levels of certain contaminants in food. Official Journal of the European Union, 2023.
2. Sobieski T.; et al. Analysis Of Mycotoxins in Food Matrices Using the Agilent Ultivo Triple Quadrupole LC/MS. Agilent Technologies application note, publication 5991-8962EN, 2019.
3. Zhao L.; Zhao H. Determination of Multiclass Multiresidue Mycotoxins in Pet Food. Agilent Technologies application note, publication 5994-7471EN, 2024.
4. Carr P. W.; Stoll D. R. Two-Dimensional Liquid Chromatography–Principles, Practical Implementation and Applications. Agilent Technologies primer, publication 5991-2359EN, 2015.
5. Agilent InfinityLab 2D-LC Solutions. Two Dimensions for Ultimate Separation Power. Agilent Technologies brochure, publication 5994-4876EN, 2022.
6. European Commission. Commission Implementing Regulation (EU) 2023/2782 of 14 December 2023 laying down the methods of sampling and analysis for the control of the levels of mycotoxins in food. Official Journal of the European Union, 2023.