Multiclass Mycotoxin Analysis in Cheese Using Agilent Captiva EMR—Lipid Cleanup and LC/MS/MS

Význam tématu

Mykotoxiny jsou toxické sekundární metabolity plísní, které mohou kontaminovat mléčné výrobky, zejména sýry s vysokým obsahem tuku. Jejich přítomnost představuje riziko pro zdraví spotřebitelů vzhledem ke karcinogenním, mutagenním a immunotoxickým účinkům. Spolehlivá detekce stopových množství mykotoxinů v komplexních matricích, jako jsou sýry, je proto klíčová pro zajištění bezpečnosti potravin a naplnění regulačních limitů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo validovat analytickou metodu pro kvantifikaci 13 různých mykotoxinů (aflatoxiny, fumonisiny, ochratoxiny, zearalenon, mykofenolová kyselina, sterigmatocystin) ve vzorcích modrých a parmazánových sýrů. Metoda kombinuje extrakci QuEChERS, následné čištění pomocí Agilent Captiva EMR–Lipid a analýzu LC–MS/MS. Studie hodnotila citlivost, přesnost, opakovatelnost a účinnost odstranění tukových a fosfolipidových interferencí.

Použitá metodika a postupy

Postup přípravy vzorku:

• Odebírání 2 g sýra do 50mL centrifugační rourky.
• Prespiking standardů a QCs, přidání 10 mL vody a inkubace 5 minut.
• Extrahování pomocí 10 mL ACN s 2 % HCOOH agitací 20 minut.
• Přidání QuEChERS solí (4 g MgSO₄, 1,5 g NaCl) a krátké protřepání.
• Centrifugace (5 000 rpm, 5 min) a přenos horní vrstvy do čisté zkumavky.
• Ředění 2 mL vodou (20 % obj.), promíchání a aplikace 2,5 mL na 3mL Captiva EMR–Lipid kartuš.
• Eluce pod gravitačním tokem, doplnění vakuové extrakce, sušení pod dusíkem (40 °C) a rekonstituce do 200 µL 85:15 (5 mM NH₄HCOO v H₂O : ACN).

Použitá instrumentace

• QuEChERS extrakční sada Agilent (p/n 5982-5555) a vakuový manifold VacElut SPS-24.
• Čištění s EMR–Lipid 3 mL (p/n 5190-1003).
• LC systém Agilent 1290 Infinity II (pumpa, autosampler, termostat) s kolonkou Poroshell 120 EC-C18 2,1×100 mm, 2,7 µm.
• MS/MS detektor Agilent 6460 Triple Quadrupole s Ionizací Jet Stream, režim Dynamic MRM.
• GC/MS full-scan pro hodnocení celkové lipidové matice.

Hlavní výsledky a diskuse

• Linearity kalibrací pro všech 13 mykotoxinů: R²>0,990 s 1/x² vážením.
• Limit detekce až 0,5 ng/g (aflatoxin M1, OTB) v sýrech.
• Obnovení (recovery) 70,7–111,8 % a opakovatelnost (RSD)<20 %, většinou <10 % pro oba typy sýra.
• Vyšší reprodukovatelnost v parmazánu než v modrém sýru díky nižší komplexitě matrice.
• Odstranění lipidů: gravimetrie ukázala redukci ko-extraktiv na 51,3 % (modrý sýr) a 74,2 % (parmazán).
• GC/MS full-scan i LC/MS/MS scany fosfolipidů dokumentovaly 61–68 % celkového odstranění matice a 92 % odstranění fosfolipidů.
• Freeze-out test: po ošetření EMR–Lipid nebyly pozorovány sražené lipidy.
• Komparace s konkurenční kartoušovou technikou: EMR–Lipid dosáhl vyšších recoverií zejména u ZON, OTA a STC.

Přínosy a praktické využití metody

• Jednoduché a rychlé čištění tukem bohatých matric bez složitého solventního přepínání.
• Možnost přímé injekce eluátu do LC–MS/MS, což zkracuje manipulace a riziko kontaminace.
• Vysoká citlivost a robustnost vhodná pro rutinní kontrolu kvality v potravinářských laboratořích.
• Univerzální aplikace pro různé třídy mykotoxinů a další lipofilní kontaminanty.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na další tukem bohaté potraviny (masné výrobky, ořechy, chocolate).
• Integrace do zautomatizovaných platforem s vyšší propustností vzorků.
• Využití ve spojení s vysokorozlišovacími MS pro neznámé metabolity a screeningové studie.
• Optimalizace pro miniaturizované extrakční postupy a zelenou analytiku.

Závěr

Studie prokázala, že Agilent Captiva EMR–Lipid poskytuje efektivní a selektivní čištění tukem bohatých sýrových vzorků pro multikulturní analýzu mykotoxinů. Validovaná metoda dosahuje nízkých detekčních limitů, vysoké přesnosti a reprodukovatelnosti a výrazně redukuje interferenční matrici. Díky jednoduchému postupu a kompatibilitě s LC–MS/MS představuje vhodné řešení pro rutinní potravinářské laboratoře.

Reference

1. Richard JL. Some major mycotoxins and their mycotoxicoses—An overview. Int J Food Microbiol. 2007;119:3–10.
2. Hymery N et al. Filamentous fungi and mycotoxins in cheese: a review. Compr Rev Food Sci Food Saf. 2014;13:437–456.
3. Bueno D et al. Determination of mycotoxins in food: a review of bioanalytical to analytical methods. Appl Spectrosc Rev. 2015;50:728–774.
4. Vaclavik L et al. Determination of multiple mycotoxins in dietary supplements containing green coffee bean extracts using UHPLC-MS/MS. J Agric Food Chem. 2013;61:4822–4830.
5. Zhang K et al. Determining mycotoxins in baby foods and animal feeds using isotope dilution and LC-MS/MS. J Agric Food Chem. 2014;62:8935–8943.
6. Zhao L, Lucas D. Agilent Technologies Application Note. 2017;5991-8598EN.