Visualization of Gefitinib and Related Metabolites in Rat Liver Using DESI-Tandem Quadrupole Mass Spectrometry

Význam tématu

Stanovení distribuce léčiva a jeho metabolitů přímo v tkáni je klíčové pro rozhodování v preklinickém vývoji léčiv. Informace o průniku do orgánů, akumulaci a prostorové lokalizaci metabolitů pomáhají hodnotit bezpečnost, selektivitu a účinnost kandidátů. Tradiční whole‑body autoradiografie s radioizotopem poskytuje kvantitativní obraz distribuce, ale postrádá chemickou specificitu pro identifikaci jednotlivých metabolitů a vyžaduje syntézu značené sloučeniny. Ambientní MS zobrazování (DESI‑MS) v kombinaci s tandemovým kvadrupólem v režimu MRM nabízí selektivní, citlivou alternativu bez potřeby radioznačení, vhodnou i pro studie v raných fázích vývoje.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat použití DESI‑MS Imaging na tandemovém kvadrupólu (Xevo TQ Absolute XR) provozovaném v MRM módu pro vizualizaci gefitinibu a souvisejících metabolitů v jaterních řezech potkanů po jednorázovém subkutánním podání (10 mg/kg). Sledovány byly časové body 0, 1, 3, 8 a 24 hodin po dávce v porovnání s kontrolními (vehicle) zvířaty a predose vzorky, s důrazem na prostorové rozložení a časový profil vybraných metabolitů.

Použitá metodika a instrumentace

Klíčové kroky a parametry:

• Vzorky: játra od samců Sprague Dawley, rychle zamražené, kryosekce tloušťky 10 µm, thaw‑mounted na standardní skleněné podložky.
• DESI‑MS imaging: DESI XS zdroj na Xevo TQ Absolute XR, pozitivní ESI režim, MRM akvizice cílených přechodů (viz tabulka MRM v originále).
• Parametry zobrazení: velikost pixelu 60 µm, nominální průměr spreje 30 µm, rychlosti akvizice 1 a 10 Hz, úhel nástřiku 75°, vzdálenost trysky 2 mm, průměr orificu iontového vstupu 6 mm2.
• Softwarové nástroje: MassLynx pro řízení MS a HDI (High Definition Imaging) pro vizualizaci dat.

Poznámka: MRM přechody používané pro gefitinib a jednotlivé metabolity byly definovány v tabulce aplikace; metoda byla cílená (targeted) pro zvýšení citlivosti a selektivity při nízkých koncentracích souvisejících s dávkami používanými v objevových studiích.

Hlavní výsledky a diskuse

Hlavní zjištění studie:

• Gefitinib a sedm souvisejících metabolitů byly detekovány v jaterních řezech po podání; v kontrolních a predose vzorcích nebyly detekovány cílové signály.
• Nejsilnější signál poskytl putativní N‑oxid metabolit (označen M594577), následovaný samotným gefitinibem a morpholino‑carbonyl metabolitem (M605211).
• Časový průběh signálů v tkáni koreloval s plasmovou farmakokinetikou: vysoká intenzita gefitinibu v 1–3 h, pokles v 8 h a stále slabě detekovatelný signál v 24 h.
• Některé metabolity (dihydroxylovaný M13) vykazovaly podobný časový profil jako mateřská látka, ovšem při nižší intenzitě; další produkty (např. M2, M5, M537194) byly v tkáni buď pod LOD nebo se objevily pouze slabě v 24 h řezech.
• MRM režim na tandemovém kvadrupólu zajistil vysokou selektivitu proti background signálům (dávkové vehikulum, endogenní ionty), díky čemuž bylo možné spolehlivě lokalizovat i nižší hladiny metabolitů bez potřeby radioznačení.

Diskuze: výsledky potvrzují, že cílené DESI‑MS v MRM módu je schopno sledovat prostorové a časové rozložení léčiva a vybraných metabolitů při farmakologicky relevantních koncentracích používaných v raných fázích vývoje. Omezení zahrnují nemožnost úplné strukturální potvrdy izomerů bez doplňující vysokorozlišovací nebo tandemu s fragmentací, a kvantifikace zobrazení, která zůstává náročnější než extrakční LC‑MS/MS.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické výhody zavedení DESI‑MRM imaging:

• Odstranění nutnosti syntézy radioizotopem značené sloučeniny, čímž se zkracuje čas a náklady na studii.
• Molekulární specifita: možnost rozlišení mateřské látky od metabolitů a sledování jejich prostorové distribuce v rámci orgánu.
• Rychlá implementace: přepnutí mezi LC‑MS a DESI‑MS na přístroji < 30 minut.
• Kompatibilita s principy 3R: snižuje potřebu samostatných značených studií a přispívá k omezení počtu zvířat.

Budoucí trendy a možnosti využití

Možné směry rozvoje a aplikace:

• Integrace cíleného DESI‑MRM s kvantitativními LC‑MS/MS analýzami pro kombinaci prostorové vizualizace a přesné kvantifikace.
• Rozšíření panelu MRM přechodů pro multiplexní sledování většího počtu metabolitů a biomarkerů současně.
• Kombinace s vysokorozlišovacími metodami nebo iontovou mobilitou pro strukturální potvrzení a rozlišení izomerů.
• Zlepšení citlivosti a rychlosti akvizice umožní práci s ještě nižšími dávkami typickými pro raný vývoj.
• Automatizace zpracování obrazů a kvantitativní kalibrace obrazových signálů vede k širšímu přijetí v GLP/QA kontextech.

Závěr

Cílené DESI‑MS Imaging na tandemovém kvadrupólu v režimu MRM představuje praktickou a citlivou metodu pro prostorovou lokalizaci léčiva a metabolitů v tkáni bez potřeby radioznačení. Studie ukázala, že gefitinib a několik jeho metabolitů lze detekovat a sledovat v jaterních řezech potkanů s časovým profilem odpovídajícím plasmové PK. Metoda nabízí rychlý workflow vhodný pro fáze objevování a předklinické studie, přičemž další rozvoj v oblasti kvantifikace a kombinace s dalšími analytickými technikami zvýší její hodnotu pro DMPK aplikace.

Reference

1. Sohlenius‑Sternbeck AK, Janson J, Bylund J. Optimizing DMPK Properties: Experiences from a Big Pharma DMPK Department. Current Drug Metabolism. 2016;17(3):253–270.
2. Mak KK, Epemolu O, Pichika MR. The role of DMPK science in improving pharmaceutical research and development efficiency. Drug Discovery Today. 2022;27(3):705–729.
3. Solon EG. Use of radioactive compounds and autoradiography to determine drug tissue distribution. Chemical Research in Toxicology. 2012;25(3):543–555.
4. Cooks RG, Ouyang Z, Takáts Z, Wiseman JM. Ambient mass spectrometry. Science. 2006;311(5767):1566–1570.
5. Dannhorn A, et al. Correlating Mass Spectrometry Imaging and Liquid Chromatography‑Tandem Mass Spectrometry for Tissue‑Based Pharmacokinetic Studies. Metabolites. 2022;12(3):261.
6. McKillop D, et al. Pharmacokinetics of gefitinib, an epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor, in rat and dog. Xenobiotica. 2004;34(10):901–915.
7. Molloy BJ, et al. Rapid determination of the pharmacokinetics and metabolic fate of gefitinib in the mouse using UPLC/MS/MS, UPLC/QToF/MS, and IM‑enabled UPLC/QToF/MS. Xenobiotica. 2021;51(4):434–446.