Tandem Quadrupole DESI Imaging To Visualize Spatial Distribution of Gefitinib and Related Metabolites in Rat Liver

Tandem Quadrupole DESI Imaging pro zobrazení prostorového rozložení gefitinibu a metabolitů v játrech potkana – shrnutí

Význam tématu:

Analýza prostorového rozložení léčiv a jejich metabolitů v tkáních je klíčová pro pochopení farmakokinetiky, farmakodynamiky a toxikologie. Metody, které umožňují bezznačkovou (label-free) lokalizaci látek v biologických řezech při terapeutických dávkách, významně zrychlují rozhodování v raných fázích vývoje léčiv a snižují závislost na radiolabelingu. Cílem prezentované studie je ukázat využitelnost DESI-MS/MS v režimu MRM na tandemovém kvadrupólu pro citlivé, cílené zobrazení gefitinibu a jeho metabolitů v játrech potkana při reálných dávkách.

Cíle a přehled studie:

- Prokázat, že DESI MRM imaging na tandemovém kvadrupólu může detekovat gefitinib a související metabolity v čerstvě zmrazených jaterních řezech po jednorázové subkutánní (SC) aplikaci 10 mg/kg.
- Porovnat prostorové obrazy s tradičním LC-MS/MS profilem v plasmě a v moči (farmakokinetika a eliminace).
- Zhodnotit časový vývoj signálů v tkáni v průběhu 24 hodin po dávce.

Použitá metodika:

- Zvířecí experiment a odběry: samci Wistar potkanů obdrželi jednorázovou SC dávku gefitinibu 10 mg/kg; krev a moč byly odebírány periodicky do 24 hodin pro PK a identifikaci metabolitů; čerstvě zmrazené jaterní vzorky byly odebrány v časových bodech 0.5, 3, 6, 8 a 24 h po dávce (4 zvířata).

- Příprava vzorků pro DESI: jaterní řezy kryosekcionovány na 10 µm a rozmístěny na standardní sklíčka, rozmrazeny v desikátoru a analyzovány bez dalšího značení; interním standardem byl gefitinib-d6.

- DESI-MSI podmínky (shrnuto):

• Instrumentace: tandemový kvadrupól Xevo TQ-Absolute XR (Waters).
• Režim analýzy: cílené MS/MS MRM přechody pro gefitinib a 6 identifikovaných metabolitů.
• DESI solvent: 98:2 methanol: voda s 0.01 % formamidové kyseliny (v/v).
• Solventní průtok: 2 µL/min; emitor 0.65 kV (pozitivní mód); sprayer tlak 0.9 bar; teplota zdroje 120 °C.
• Cone voltage: 13–22 V; rozlišení MS1/MS2 ~0.75 Da FWHM.

- Podpora LC-MS/MS: ACQUITY Premier UPLC s BEH C18 (2.1×100 mm, 1.7 µm) pro plasmové a močové analýzy; vzorková příprava zahrnovala precipitaci bílkovin (plasma 5 µL + 4:1 acetonitril:methanol) a SPE (moč, Oasis HLB). Data zpracována pomocí TargetLynx XS; doplňková analýza s využitím Skyline a MetaboAnalyst.

Hlavní výsledky a diskuse:

- Detekce: metodika umožnila zobrazit gefitinib a šest metabolitů přímo v jaterních řezech při terapeutické dávce (10 mg/kg) bez nutnosti radiolabelingu nebo použití vysokých, toxických dávek.

- Časový průběh: většina sledovaných látek vykazovala nejvyšší intenzity signálu přibližně 1 h po dávce a zůstávala nad hranicí detekce i po 24 h; to korespondovalo s PK profily získanými z LC-MS/MS analýz plazmy a moči.

- Korelace s PK: intenzity DESI obrazů pro parentální látku a klíčový metabolit M11 dobře odpovídaly eliminačním a plazmatickým koncentracím z LC-MS/MS, což podporuje použitelnost DESI MRM pro relační kvantitativní hodnocení (semi‑kvantitativní trendové porovnání s LC-MS/MS).

- Prostorové rozložení: DESI poskytl obraz, který ukázal heterogenní lokální distribuci léku a metabolitů v jaterní tkáni; přítomnost endogenního markeru (karnitin) byla demonstrována pro orientaci na tkáňové struktury.

- Citlivost a selektivita: použití MRMs (zachycení „fingerprint“ fragmentu) na tandemovém kvadrupólu zvýšilo selektivitu a citlivost přístupu, přiměřeně k požadavkům cíleného zobrazení při nízkých dávkách.

Přínosy a praktické využití metody:

• Možnost rychlého, bezznačkového mapování rozložení léčiva a metabolitů v tkáních v raných fázích vývoje léků.
• Redukce potřeby radiolabelingu a vysokých dávek pro detekci — relevantnější údaje pro terapeutické podmínky.
• Podpora rozhodnutí v DMPK a toxikologii: lokalizace metabolitů může indikovat potenciální lokální toxické efekty nebo metabolická ohniska.
• Komplement k LC-MS/MS: DESI poskytuje prostorová data, LC‑MS/MS poskytuje přesné kvantitativní PK údaje; kombinace zvyšuje hodnotu interpretace ADME dat.

Omezení:

• Cílený MRM přístup omezuje schopnost objevovat dosud neznámé metabolity bez předchozích MRM přechodů.
• Prostorové rozlišení DESI je nižší než u některých jiných zobrazovacích technik (např. MALDI), což omezuje detailní lokalizaci na úrovni buněčných struktur.
• Kvantifikace je v obrazovém režimu často semi‑kvantitativní a vyžaduje korelaci s tradičními LC‑MS/MS daty pro přesné koncentrace.

Použitá instrumentace:

• DESI zdroj a DESI XS systém (Waters) připojený k Xevo TQ-Absolute XR tandemovému kvadrupólu.
• ACQUITY Premier UPLC s kolonkou BEH C18 (2.1×100 mm, 1.7 µm) pro LC-MS/MS vyšetření plazmy a moče.
• Oasis HLB SPE kartičky (Waters) pro přípravu močových vzorků; interní standard gefitinib‑d6.
• Software: TargetLynx XS; doplňkové analýzy pomocí Skyline a MetaboAnalyst 6.0.

Budoucí trendy a možnosti využití:

• Integrace cíleného DESI MRM s vysokorozlišovacími MS technikami pro současné zlepšení identifikace neznámých metabolitů a prostorového zobrazení.
• Vývoj kvantitativních DESI protokolů s homogeními a lokalizovanými interními standardy pro přesnou mapovou kvantifikaci.
• Multimodální zobrazování (histologie, IMS, autoradiografie) pro komplexní korrelaci struktury, funkce a distribuce.
• Automatizace a softwarová analýza (AI/ML) pro rychlé vyhodnocení obrazů a predikce farmakokinetických fenotypů v tkáních.
• Aplikace na preklinická toxikologická hodnocení, vývoj cílených formulací a případně translace do klinických biopsií.

Závěr:

Studie ukazuje, že cílené DESI-MRM na tandemovém kvadrupólu je praktický a citlivý přístup pro prostorové mapování gefitinibu a jeho metabolitů v jaterní tkáni při terapeutických dávkách. Výsledky souzní s LC‑MS/MS PK profily a poskytují dodatečný informační rozměr — lokalizaci ve tkáni — který může významně podpořit rozhodování v DMPK, toxikologii a vývoji léčiv. Metoda nabízí atraktivní kompromis mezi jednoduchostí přípravy, citlivostí a možností nasazení v rané fázi vývoje, s potenciálem dalšího rozvoje směrem k kvantitativnímu a multimodálnímu zobrazování.

Reference:

1. McKillop D et al. 2004. Xenobiotica. 34(10): 901-915. doi: 10.1080/00498250400009189; Xenobiotica. 34(10):917-934. doi: 10.1080/00498250400009171; Xenobiotica. 34(11-12): 983-1000. doi: 10.1080/02772240400015222.
2. Molloy BJ et al. 2021. Xenobiotica. 51: 434–446. doi.org/10.1080/00498254.2020.1859643.
3. Morato NM, Cooks RG. 2023. Accounts of Chemical Research. 56(18): 2526-2536. doi.org/10.1021/acs.accounts.3c00382.