Investigating the Strength of the Sense and Antisense Oligonucleotide Interaction to Form siRNA Duplexes Using the BioAccord™ LC-MS System

Význam tématu

Analýza intactních siRNA duplexů a vyhodnocení síly asociace mezi sense a antisense řetězci je klíčová pro vývoj terapeutických oligonukleotidů. Schopnost přímo měřit nerozštěpené duplexy poskytuje důležité informace o identitě, čistotě a stabilitě kandidátních léčiv a umožňuje rychlé rozhodování v preklinickém a kontrolním prostředí. Metody, které zachovávají vyšší řád struktury (native-like podmínky) a zároveň poskytují přesnou hmotnostní charakterizaci, zlepšují kvalitu analytiky a šetří čas i zdroje ve vývoji oligonukleotidových terapií.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikovaného článku bylo vyvinout jednotný HILIC-UV/MS postup na platformě BioAccord LC-MS pro analýzu intactních siRNA duplexů za podmínek blízkých nativním a demonstrovat, že LC–UV/MS může rozlišit duplexy s odlišnou vazebnou silou mezi sense a antisense řetězci. Studie porovnává chování tří komerčně dodaných siRNA duplexů po HILIC chromatografii a následné ESI-TOF detekci, s důrazem na in-source disociaci jako indikátor relativní stability duplexu.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Vzorky: tři lyofilizované siRNA duplexy (SEM1, AIDA, ATPase PAAT) od výrobce Abbexa; zásobní roztoky 50 µM ve vodě, 5 µM pracovní roztoky připravené 1:10 s mobilní fází A.
• Chromatografie: HILIC gradient na ACQUITY Premier BEH Amide sloupci (1.7 µm, 2.1 x 50 mm) při 35 °C, průtok 300 µL/min, injekční objem 1 µL. Mobilní fáze A: 75 % acetonitrilu, 10 mM acetátu amonného (v dokumentu se objevuje pH 9.0 při přípravě a pH 6.8 v popisu mobilních fází — metoda uvádí pH 6.8 pro běžný provoz). Mobilní fáze B: 25 % acetonitrilu v DI vodě, 10 mM acetátu amonného, pH 6.8. Vzorky uchovávány při 6 °C.
• Detekce UV: ACQUITY UPLC TUV detektor při 260 nm.
• Mass spectrometrie: BioAccord ESI-TOF v negativním ionizačním módu; capillary 0.8 kV, cone 20 V, source temp 120 °C, desolvation temp 500 °C, desolvation plyn (N2) 6.5 bar, TOF rozsah 400–5000 m/z, akviziční rychlost 2 Hz; použit LockMass pro kalibraci dat.
• Data a zpracování: waters_connect Software; dekonvoluce hmotností v INTACT Mass App s BayesSpray algoritmem pro získání neutrálních monoizotopových hmotností.

Instrumentace (samostatná sekce):

• BioAccord LC-MS System se ACQUITY Premier UPLC
• ACQUITY Premier BEH Amide 1.7 µm, 2.1 x 50 mm (p/n: 186009504)
• ACQUITY UPLC TUV detektor
• TOF detektor s ESI zdrojem (BioAccord ESI-TOF)
• Software: waters_connect, INTACT Mass App (BayesSpray deconvolution)

Hlavní výsledky a diskuse

HILIC separace při 35 °C zachovala intactní duplexní formu u všech tří siRNA vzorků, což se projevilo jedním dominantním UV-píkem pro každý vzorek navzdory přítomnosti nečistot a jednotlivých oligonukleotidových komponent. MS spektrometrie ukázala úzké rozložení nábojových stavů (-5 až -7), typické pro kompaktní duplexní strukturu v plynu. Klíčové poznatky:

• Dva duplexy (SEM1 a AIDA) vykazovaly částečnou in-source disociaci: vedle intactního duplexu se v MS objevily signály jednotlivých sense a antisense řetězců. To indikuje, že interakce mezi řetězci v těchto případech nebyla natolik silná, aby odolala přechodu do plynu při použitých zdrojových podmínkách.
• ATPase PAAT duplex byl výrazně stabilnější v plynu: dominantní signál představoval intactní duplex s velmi nízkou mírou in-source disociace, což svědčí o silnější vlákynové (base-pairing/stacking) a elektrostatické stabilizaci mezi řetězci.
• IR-RP chromatografie u stejných podmínek způsobila denaturaci duplexů — detekovány byly pouze samostatné řetězce — což potvrzuje, že HILIC může zachovat vyšší řád struktury oligonukleotidů, zatímco IP-RP je denaturační pro duplexy.
• Optimalizace zdrojových parametrů (capillary, cone, teploty, průtok plynu) minimalizovala disociaci, nicméně rozdíly mezi duplexy přetrvaly, takže relativní stabilita je inherentní vlastností analyzovaných sekvencí/kompozic.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda HILIC-UV/MS na BioAccord platformě nabízí několik přínosů:

• Možnost analýzy intactních siRNA duplexů (identifikace a potvrzení monoisotopické hmotnosti) bez nutnosti denaturace či použití ion‑pairing reagencií nebo toxických HFIP založených modifierů.
• Současné pořízení UV a MS signálů umožňuje paralelní kvantitativní a kvalitativní hodnocení (integrita duplexu vs. volné řetězce a nečistoty).
• Praktické využití v identifikaci, kontrole čistoty, stabilitních studiích a pro vývoj QC metod u oligonukleotidových terapeutik.
• Metoda je kompatibilní s integrovaným datovým prostředím (waters_connect), což zjednodušuje vývoj, validaci a přenos metod mezi laboratořemi.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje a aplikace této analytiky zahrnují:

• Rozšíření nativních HILIC-MS metod na širší škálu modifikovaných oligonukleotidů (chemické modifikace, konjugáty, delší duplexy).
• Integrace s ion mobility spektrometrií (IMS) pro rozlišení konformací a detailnější hodnocení vyšších řádů struktury.
• Využití standardů siRNA duplexů a kvantitativních pracovních postupů pro robustní QC a regulované prostředí.
• Pokročilé softwarové nástroje pro dekonvoluci a automatizované přiřazení složených spekter, včetně algoritmů založených na Bayesovských přístupech pro vyšší přesnost masa.
• Využití výsledků in-source stability jako komplementárního parametru při návrhu sekvencí a modifikací s cílem zvýšit biologickou stabilitu a účinnost doručení.

Závěr

Studie prokázala, že HILIC-UV/MS provedené na BioAccord LC-MS systému dokáže zachovat a měřit intactní siRNA duplexy a současně poskytovat informace o relativní síle asociace sense/antisense řetězců prostřednictvím míry in‑source disociace. Metoda nabízí bezpečnější, MS‑přátelské mobilní fáze bez ion‑pairing modifikátorů, podporuje kvalitativní i kvantitativní charakterizaci siRNA a je vhodná pro implementaci v prostředích vývoje a kontroly kvalit oligonukleotidových léčiv.

Reference

1. Goyon A., Yehl P., Zhang K. Characterization of Therapeutic Oligonucleotides by Liquid Chromatography, J Pharm Biomed Anal, 2020, 182, 113105.
2. Vinjamuri B.P., Pan J., Kawakami J., Peng P. A Review on Commercial Oligonucleotide Drug Products, J Pharm Sci, 2024, 113, 1749–1768.
3. Togawa H., Yamaguchi T., Kawakami J., Obica S. Current Trends in Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis of small Interfering rNAs: A short review, Anal Chem, 2026, 98, 10895–10912.
4. Bardawil S.A., Barthelemy P., Ferey L. Advances in the Analysis of Therapeutic Oligonucleotides with Chromatography Coupled to Mass Spectrometry, Anal Chem, 2026, 98, 10895–10912.
5. Hirschberger R., Rühl M., Fox J., Yu Y.Q., Berger S. Characterization and Sequencing of Duplex siRNA Using the BioAccord LC-MS System and VION IMS QTof Mass Spectrometer..., Waters Application Note, 2024.
6. Fekete S., Araya M., Addepalli B., Lauber M.A. Studying Mobile Phases for HILIC UV/MS Analysis of Oligonucleotide Therapeutics..., Waters Application Note, 2024.
7. Huang M., Xu X., Qiu H., Li N. Analytical Characterization of DNA and RNA oligonucleotides by HILIC-Tandem MS, J Chrom A, 2021, 1648, 462184.
8. Doneanu C.E., Yu Y.Q., Fredette J., Warren W.J., Chen W. HILIC as an Alternative Separation Mode for Intact Mass Confirmation of Oligonucleotides on the BioAccord System, Waters Application Note, 2021.
9. Berthelette K.D., Kalwood J., Haynes K. Development and Optimization of a HILIC MS Separation of 17 Free Amino Acids Using an XBridge Premier BEH Amide Column, Waters Application Note, 2023.
10. Shion H., Boyce P., Berger S.J., Yu Y.Q. INTACT Mass – A Versatile waters_connect Application for Rapid Mass Confirmation and Purity Assessment of Biopharmaceuticals, Waters Application Note, 2022.
11. Skilling J., et al. Beyond MaxEnt Deconvolution: Bayesian Probability Theory for Mass Spectral Deconvolution of Biomolecules, Waters Poster, 2020.