Studying Mobile Phases for HILIC UV/MS Analysis of Oligonucleotide Therapeutics including an siRNA Duplex, a Lipid Conjugated ASO, and a CRISPR sgRNA

Význam tématu

Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) představuje perspektivní alternativu k iontově pářeným metodám pro separaci oligonukleotidů. Odstraňuje potřebu iontově párovacích činidel a zlepšuje kompatibilitu s hmotnostní spektrometrií. Díky tomu je vhodná pro analýzu syntetických RNA a DNA terapií, včetně duplexů, lipidově konjugovaných oligonukleotidů a sgRNA.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo systematicky optimalizovat mobilní fáze HILIC pro separaci oligonukleotidů a ověřit jejich využití v UV a MS detekci. Autoři porovnali různé amoniakální soli, teplotu, gradient a přinesli řešení pro omezení jevu „breakthrough“ pomocí sekvenované injekce. Studie zahrnuje modelové vzorky: dT a ssDNA žebříčky, siRNA duplex, lipid konjugované ASO a CRISPR sgRNA.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Design of experiments (DoE) pro screening gradientu, teploty a koncentrace soli.
• Optimalizace gradientního programu s využitím DryLab™ 4.4.
• Sekvenovaná („bracketed“) injekce pro potlačení průniku vzorku.
• Studie teplotního vlivu na stabilitu duplexů (určení Tm).
• HILIC-UV a HILIC-MS analýza.

Instrumentace:

• ACQUITY UPLC H-Class Bio System s Binary Solvent Manager a ACQUITY Premier hardware.
• GTxResolve Premier BEH Amide Column, 300 Å, 1,7 µm, 2,1 × 50 mm.
• ACQUITY TUV Detector (Titanium Flow Cell, 5 mm, 1500 nL).
• Empower Pro 3 software.
• BioAccord LC-MS System pro hyphenaci HILIC s hmotnostní spektrometrií.

Hlavní výsledky a diskuse

1. Porovnání tří amoniakálních solí (acetát, formiát, hydrogenuhličitan):

• Acetát a formiát poskytují téměř totožnou retenci a selektivitu.
• Hydrogenuhličitan vykazuje nižší retenci, je ale použitelný po drobné úpravě gradientu.

2. Sekvenovaná injekce:

• Před- a po-injekční plug acetonitrilu eliminuje split peak a průnik pro vodné injekce.
• Povolení až 2 µL vodného vzorku bez významného rozostření.

3. Teplotní efekt:

• Nižší teploty (< Tm) zachovávají duplexy v nativním stavu.
• Přechod přes Tm (~60 °C pro testovaný siRNA duplex) vede k dissociaci a rozdělení špiček.

4. HILIC-MS analýza:

• 75 °C kolona a 100 mM amoniakálního acetátu umožnily čistou MS detekci 32 277 Da CRISPR sgRNA.
• Analýza lipid konjugovaného ASO s 25 mM acetátu odhalila dvě izobarické diastereomery a nečistotu -419 Da.

Přínosy a praktické využití metody

• Odstranění iontově párovacích činidel ulehčuje přímou hyphenaci na MS.
• Flexibilita provozu v denaturačních či nativních podmínkách umožňuje kontrolu duplex stability.
• Bracketed injekce rozšiřuje rozsah vzorkové matrice bez ztráty kvality chromatogramu.
• DoE přináší systematickou a rychlou optimalizaci metoda pro různé typy oligonukleotidů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace HILIC-MS metod do rutinní vývojové a QC fáze oligonukleotidových léčiv.
• Další modelování retence pro prediktivní vývoj metod pomocí multidimenzionálních přístupů.
• Vyšší přizpůsobení mobilních fází pro modifikované a dlouhé RNA sekvence.
• Pokročilé injekční techniky pro vysoce vodné či komplexní biologické vzorky.

Závěr

Studie potvrdila, že HILIC je robustní, citlivá a MS-přátelská technika pro analýzu oligonukleotidů. Optimalizace mobilních fází, teploty a injekční techniky přinesla vysoce reprodukovatelné a selektivní separace, vhodné pro výzkum i QC oligonukleotidových terapeutik.

Reference

1. Gilar M. et al. J. Chromatogr. A 1712 (2023) 464475.
2. Goyon A. et al. J. Chromatogr. A 1708 (2023) 464327.
3. Lardeux H. et al. Anal. Chem. 96 (2024) 9994–10002.
4. Gilar M. et al. J. Chromatogr. A 1733 (2024) 465285.
5. Lobue P.A. et al. J. Chromatogr. A 1595 (2019) 39–48.
6. Anand P. et al. Bioanalysis 14 (2022) 47–62.
7. Goyon A. et al. Anal. Chem. 93 (2021) 14792−14801.
8. Bobaly B. et al. J. Chromatogr. B 1060 (2017) 325–335.
9. Lardeux H. et al. TrACs 176 (2024) 117758.
10. Perez-Robles R. et al. J. Chromatogr. A 1713 (2024) 464498.
11. Fekete S. et al. Waters Application Note 720008460 (2024).