LC-MS Analysis of Two mRNA Critical Quality Attributes: 5’-Capping Efficiency and Average Poly(A) Tail Length and Heterogeneity Using the Xevo™ MRT Mass Spectrometer

Význam tématu

Rychlá a přesná analýza kritických kvalitativních parametrů (CQAs) mRNA — především 5'-capping efficiency a délky a heterogenity poly(A) ocasu — je klíčová pro vývoj, validaci a rutinní kontrolu mRNA vakcín a terapeutik. Schopnost měřit tyto atributy v jediném, robustním LC‑MS workflow zkracuje vývojové cykly, snižuje náklady a zvyšuje připravenost na regulaci a uvolňování sérií pro klinické použití.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout optimalizované LC‑MS a informační workflow schopné současně kvantifikovat 5'-capping efficiency a průměrnou délku poly(A) ocasu v jediném měření. Práce demonstruje aplikaci na modelovém Fluc mRNA (~1 813 nt + poly(A)) za použití vysokorozlišovacího Xevo MRT orbitálního/TOF přístroje a tří aplikací waters_connect (SYNTHETIC Library, INTACT Mass, MAP Sequence) pro automatizované zpracování dat.

Použitá instrumentace

• Xevo MRT (multi‑reflecting TOF) Mass Spectrometer
• ACQUITY Premier UPLC (Binary) System
• ACQUITY Premier Oligonucleotide BEH C18, 2.1 × 150 mm, 1.7 µm, 130 Å
• waters_connect software: INTACT Mass v1.9, SYNTHETIC Library v2.0, MAP Sequence v2.0

Použitá metodika

Vzorky: in vitro transkribovaná Fluc mRNA s Cap‑1 a poly(A) ocasem. Enzymatické štěpení: hRNase4 (pro informace o 5' konci) — denaturace 2 min při 90 °C, štěpení 37 °C 15 min; RNase T1 (pro poly(A) izolaci z komplexního digestu) — denaturace stejná, štěpení 37 °C 90 min. Digesty byly analyzovány ihned (5 µL injekce).

Chromatografie: ion‑pairing reverzní fáze (IP‑RP) s mobilními fázemi obsahujícími 10 mM n‑dipropylamin (DPA) a 40 mM HFIP; teplota kolony 60 °C; průtok 300 µL/min. Poly(A) komponenty koelutují v jediném vrcholu při ~78 min (dlouhý gradient přizpůsoben pro separaci oligonukleotidů).

MS podmínky: ESI v negativním módu, MSE (DIA), rozsah m/z 50–4000, rychlost akvizice 2 Hz, capillary 1.5 kV, desolvace 550 °C, desolv. plyn 1000 L/h, nízká energie CE 6 V, vysoká energie ramp 15–35 V. Lock‑mass použití Leu Enk pro zajištění přesnosti.

Informatika: akvizice a předzpracování v waters_connect; předpovědi neznámých komponent SYNTHETIC Library; sekvenční ověření MAP Sequence; dekonvoluce a určení hmotností poly(A) v INTACT Mass (MaxEnt1 algoritmus).

Hlavní výsledky a diskuse

CQA1 — 5' capping efficiency:

• Detekovány byly dvě Cap‑1 varianty lokalizované na stejném 5' digesčním produktu (9‑mer): m7GpppAm‑GGGAAAUcP a m7GpppGm‑GGGAAAUcP.
• Kvantifikace na základě integrovaných ploch XIC ukázala poměr ~62.7 % pro m7GpppAm a 37.3 % pro m7GpppGm.
• Volné (necapped) 5' produkty nebyly detekovány — celkové capping efficiency byla interpretována jako 100 %, což je konzistentní s po‑IVT dephosphorylační úpravou, která degraduje necapped transkripty.
• RNase T1 není vhodná pro analýzu 5' capu u této sekvence, protože vytváří příliš krátké oligonukleotidy, které se za IP‑RP podmínek neměří dobře.

CQA2 — průměrná délka a heterogenita poly(A):

• RNase T1 digest produkoval dobře separovaný, koeluční vrchol polyadenosinu (retence ~78 min), obsahující složité spektrum poly(A) komponent.
• Akvizice ukázala množství nabitých stavů (−24 až −36) pro nejintenzivnější komponentu, identifikovanou jako 102‑mer (složením C(A)101).
• Dekonvolucí v INTACT Mass bylo determinováno devět samostatných poly(A) variant o délce 98–106 nukleotidů; nejhojnější 102‑mer přispíval 19.3 % signálu.
• Průměrná délka poly(A) byla vypočtena jako 102.3 nukleotidů (průměrná molekulová hmotnost 33 608.0 Da) z komponent nad 2 % relativního zastoupení.
• Vysoké rozlišení Xevo MRT (~100 000) umožnilo rozlišení izotopických distribucí vysoce nabitých iontů a dosažení hmotnostní přesnosti <10 ppm pro identifikované poly(A) komponenty.

Diskuse: vysoké rozlišení a přesnost hmotnosti Xevo MRT spolu s automatizovaným zpracováním v waters_connect dovolily provést obě analýzy v jednom běhu, čímž se zkrátil čas měření a snížila potřeba manuální interpretace. Analýza poly(A) zůstává náročná kvůli nižší ionizační účinnosti, vyšší heterogenitě a náchylnosti k degradaci, přesto výsledky ukázaly reprodukovatelné identifikace a přesné kvantifikace hlavních komponent.

Přínosy a praktické využití metody

• Jednotný LC‑MS assay pro současné stanovení 5' capu a poly(A) šetří čas a materiál a je vhodný pro vývoj, QC a release testing.
• Automatizované aplikační toky (SYNTHETIC Library, MAP Sequence, INTACT Mass) snižují manuální zásahy a zvyšují reprodukovatelnost reportů.
• Vysoká hmotnostní přesnost a rozlišení usnadňují detekci minoritních variant capu a rozlišení sekvenčně blízkých poly(A) komponent.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další automatizace a standardizace workflow pro průmyslové QC, včetně validace postupu a referenčních standardů pro poly(A) a cap struktury.
• Využití alternativních nebo kombinovaných nukleáz a předúprav (enrichments, chemická stabilizace) pro lepší záchyt menších nebo labilních fragmentů.
• Zvýšení propustnosti analýz (krátké gradienty, multiplexing) a integrace s LIMS pro rutinní výrobní kontrolu.
• Rozšíření metodiky na jiné mRNA konstrukty, inkl. modifikovaných nukleotidů a komplexních 5' nebo 3' modifikací, a nasazení v regulačně orientovaných studiích.
• Možnost kombinace s dalšími technologií (např. nativní MS, hyphenované obohacení poly(A) pomocí dT‑beads) pro hlubší charakterizaci heterogenity.

Závěr

Studie prokázala, že výkon Xevo MRT MS v kombinaci s waters_connect aplikacemi umožňuje spolehlivou, vysoce přesnou analýzu dvou klíčových mRNA CQA v jediném LC‑MS běhu. Workflow nabízí praktický přínos pro zrychlení vývoje mRNA léčiv a jejich průmyslové kontroly díky snížení doby analýzy, automatizaci zpracování dat a schopnosti detekovat minoritní varianty.

Reference

1. Xu, S.; Yang, K.; Li, R.; Zhang, L. Vaccine era - Mechanisms, Drug Platform and Clinical Prospection, Intl J Mol Sci Chem, 2020, 21 (18), 6582.
2. Verbeke, R.; Lentacker, I.; De Smedt, S.C.; Dewitte, H. The dawn of mRNA vaccines: The COVID-19 case. J Controlled Release, 2021, 333, 511-520.
3. Jackson, N.A.; Kester, K.E.; Casimiro, D.; Gurunathan, S.; DeRosa, F. The Promise of mRNA vaccines: A biotech and industrial perspective. npj Vaccines, 2020, 5.
4. D'Esposito, R.J.; Doneanu, C.E.; Gastall, H.; Berger, S.J.; Yu, Y.Q. RNA CQA Analysis using the BioAccord LC‑MS System and INTACT Mass waters_connect Application. Waters Application Note, 2023.
5. Addepalli, B.; et al. Analysis of mRNA Cap Impurity Profiles and Capping Efficiency Using RapiZyme MC1 Ribonuclease. Waters Application Note, 2025.
6. Doneanu, C.E.; Fredette, J.; Yu, Y.Q. Ion‑Pairing Reversed Phase LC‑MS Analysis of Poly(A) Tail Heterogeneity Using the BioAccord LC‑MS System. Waters Application Note, 2023.
7. Doneanu, C.; Gomes, A.F.; Preston, C.; et al. Sequence Mapping of mRNA Digests using the Xevo MRT Mass Spectrometer and MAP Sequence 2.0 Application. Waters Application Note, 2025.
8. Sheets, M.D.; Wickens W. Two phases in the addition of a Poly(A) Tail, Genes & Develop, 1989, 3, 1401.
9. Dreyfus, M.; Regnier, P. The Poly(A) Tail of mRNAs: bodyguard in eukaryotes, scavenger in bacteria, Cell, 2002, 111, 611.
10. Chang, H.; Lim, J.; Ha, M.; Kim, V.N. TAIL‑seq: genome‑wide determination of Poly(A) tail length and 3’ end modifications, Mol Cell, 2014, 53, 1044.
11. Nicholson, A.L.; Pasquinelly, A.E. Tales of detailed Poly(A) Tails, Trends Cell Biol, 2019, 29, 191.
12. Beverly, M.; Hagen, C.; Slack, O. Poly A tail length analysis of in vitro transcribed mRNA by LC‑MS, Anal Bioanal Chem, 2018, 410, 1667.
13. Gilar, M.; Doneanu, C.; Gaye, M.M. Liquid chromatography methods for analysis of Poly A tail length and heterogeneity, Anal Chem, 2023, 95, 14308.
14. Goyon, A.; et al. Online determination of Poly(A) Tail length and content, Anal Chem, 2025, 97 (39), 21572.
15. Ferrige, A.G.; Seddon, M.J.; Green, B.N.; Jarvis, S.A.; Skilling, J. Disentangling electrospray spectra with maximum entropy, Rapid Commun. Mass Spectrom., 1992, 6, 707.
16. Shion, H.; Boyce, P.; Berger, S.J.; Yu, Y.Q. INTACT Mass™ - a Versatile waters_connect™ Application for Rapid Mass Confirmation and Purity Assessment of Biotherapeutics. Waters Application Note, 2022.