Head to Tail Analysis of mRNA by RapiZyme™ MC1 and Cusativin

Význam tématu

Therapeutická mRNA se stala klíčovou platformou v moderní medicíně (vakcíny, onkologie, genetické terapie). Kritické kvalifikační atributy (CQAs) jako 5′ cap, délka a homogenita poly(A) ocasu a integrita sekvence rozhodují o stabilitě, translaci a farmakologickém účinku mRNA. Robustní analytické postupy, které dokážou tyto atributy hodnotit rychle a komplexně, jsou nezbytné pro kontrolu kvality, vývoj a validaci výrobních procesů mRNA léčiv.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo ukázat, že kombinované použití ribonukleáz RapiZyme MC1 a Cusativin umožní jednotný „head-to-tail" enzymatický rozklad mRNA, který současně poskytne informace o 5′ cap struktuře a souvisejících nečistotách, délkové heterogenitě poly(A) ocasu a identity sekvence v jedné přípravě. Studie demonstruje optimalizované podmínky štěpení, chromatografii, MS akvizici a integrovanou informatikou pro komplexní charakterizaci mRNA na modelovém FLuc konstruktu (unmodified a m1Ψ-modified).

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Příprava rozštěpení: 20 µg mRNA denaturováno 90 °C/2 min, rychlé ochlazení; přidání enzymu (300 U pro nemodifikovanou, 600 U pro m1Ψ-modifikovanou), celkový objem 60 µL v 100 mM acetátu amonného (pH 8.0 pro MC1, pH 9.0 pro Cusativin); inkubace 30 °C/60 min; inaktivace 70–75 °C/15 min.
• Chromatografie: IP-RP UPLC na ACQUITY Premier Oligonucleotide BEH C18 (2.1×150 mm, 1.7 µm) při 70 °C, tok 0.4 mL/min; mobilní fáze obsahují DIPEA a HFIP v kombinaci vody/acetonitrilu.
• MS akvizice: Xevo MRT, ESI- režim negativní, MSE (DIA) rozsah m/z 50–4000, rampa vysoké kolizní energie 25–45 V; data MS1 a MS2 použita k přiřazení štěpných produktů a identifikaci modifikací.
• Informatika: waters_connect platforma s aplikacemi INTACT Mass (polyA a cap analýza), CONFIRM (MS/MS ověření), Synthetic Library (in silico štěpení) a MAP Sequence (mapování sekvence), dekonvoluce MaxEnt1 pro poly(A) spektra.

Použitá instrumentace

• UPLC: ACQUITY Premier UPLC System se systémem pro binární rozpouštědla a řízení teploty.
• Kolona: ACQUITY Premier Oligonucleotide BEH C18, 130 Å, 1.7 µm, 2.1×150 mm.
• MS: Xevo MRT Mass Spectrometer (ESI-, MSE režim).
• Vials a spotřební materiál: QuanRecovery Vials s MaxPeak HPS povrchem; HFIP a DIPEA jako ion‑pairing činidla.
• Software: waters_connect (INTACT Mass, CONFIRM, Synthetic Library, MAP Sequence), MaxEnt1 pro dekonvoluci.

Hlavní výsledky a diskuse

5′ capping:

• MC1 digest umožnil detekci kompletně capovaných, necapovaných a cap souvisejících nečistot. Pro nemodifikované FLuc byly naměřeny rozdělení: Cap1 98.42 %, pNm‑impurity 1.35 % a uncapped 0.23 %. Pro m1Ψ‑modifikovaný FLuc: Cap1 98.83 % a uncapped 1.17 % — tedy vysoká účinnost capování.

Sekvenční krytí:

• Kombinované použití MC1 a Cusativin vedlo k významnému zvýšení sekvenčního pokrytí. Pro nemodifikovaný FLuc bylo dosaženo 93 % (MC1: 82.9 %, Cusativin: 67.5 %); pro m1Ψ‑modifikovaný FLuc 77.8 % kombinovaně. Některé chromatografické píky zůstaly neidentifikované, což naznačuje možnost dodatečné manuální kontroly nebo optimalizace podmínek pro zlepšení krytí.

Poly(A) ocaso výsledek:

• Poly(A) peak se objevoval v RT ~40.85–40.89 min. Dekonvoluce ukázala rozložení hmotností odpovídající poly(A) ocasu 104–114 nt s vrcholem na ~111 nt (36,487 Da), přičemž každá délka často vykazovala tripletní vzor s posuny −24 Da a −48 Da, interpreto‑vané jako jedna či dvě rA→rC náhrady. To odpovídá známé schopnosti E. coli PAP inkorporovat CTP během polyadenylace.

Diskuse:

• Kombinace dvou enzymů s rozdílnou specifitou poskytuje komplementární štěpné vzorce, což zvyšuje přístupnost k mapování delších RNA. Modifikace nukleotidů (m1Ψ) snižují částečně sekvenční krytí, pravděpodobně vlivem změněné štěpnosti nebo ionizace.

Přínosy a praktické využití metody

• Jednovinková workflow umožňuje souběžné hodnocení 5′ cap stavu, poly(A) délky/heterogenity a identity sekvence bez nutnosti separátních enzymatických kroků nebo rozsáhlé přípravy.
• Snížení analytické složitosti a času: jeden digest, jedna LC‑MS analýza a integrované softwarové zpracování.
• Užitečné pro QC/QA laboratoře a vývoj výrobních procesů mRNA — možnost rutinní kontroly capping efficiency, detekce capping‑byproducts a monitorování polyadenylace.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další rozvoj enzymatických panelů pro zlepšení krytí sekvence a cílenou lokalizaci modifikací nukleotidů.
• Integrace s automatizovanými pracovními stanicemi a vyšším průtokem pro komerční QC nasazení.
• Vylepšení informatiky: lepší algoritmy pro dekonvoluci, automatické řešení nepřiřazených píků a robustnější detekce heterogenity poly(A).
• Komplementární využití jiných analytických technik (např. nanopore sekvenování) pro validaci a úplné mapování modifikací.
• Standardizace a akceptace postupů regulačními orgány pro certifikaci CQAs mRNA produktů.

Závěr

Studie prokazuje, že kombinované štěpení RapiZyme MC1 a Cusativin spolu s IP‑RP UPLC‑MSE a pokročilou informatikou umožňuje komplexní, efektivní a relativně rychlou charakterizaci klíčových CQA mRNA: cappingu, poly(A) délky/heterogenity a sekvenční identity. Přístup snižuje počet samostatných analytických workflow a nabízí praktický nástroj pro vývoj a kontrolu kvality moderních mRNA terapeutik, přičemž další optimalizace může zlepšit pokrytí pro modifikované nukleotidy a nevyřešené chromatografické píky.

Reference

1. Qin S. et al. mRNA‑based therapeutics: powerful and versatile tools to combat diseases. Signal Transduct. Target. Ther. 2022, 7, 166.
2. Camperi J. et al. Comprehensive impurity profiling of mRNA: evaluating current technologies and advanced analytical techniques. Anal. Chem. 2024, 96, 3886–3897.
3. Stepinski J. et al. Synthesis and properties of mRNAs containing the novel anti‑reverse cap analogues. RNA 2001, 7, 1486–1495.
4. Trepotec Z. et al. Segmented poly(A) tails significantly reduce recombination of plasmid DNA without affecting mRNA translation efficiency or half‑life. RNA 2023, 25, 507–518.
5. Fuchs A. L. et al. A general method for rapid and cost‑efficient large‑scale production of 5’ capped RNA. RNA 2016, 22, 1454–1466.
6. Addepalli B. et al. Tunable digestions of RNA using RapiZymes RNases to confirm sequence and map modifications. Waters application note, 720008539, Sep 2024.
7. Addepalli B. et al. Analysis of mRNA cap impurities profiles and capping efficiency using RapiZyme MC1 ribonuclease. Waters application note, 720008793, June 2025.
8. Doneanu C. et al. Sequence mapping of mRNA digests using Xevo MRT Mass spectrometer and waters_connect MAP Sequence 2.0 application. Waters application note, 720009171, Dec 2025.
9. Yehudai‑Resheff S.; Schuster G. Characterization of the E. coli poly(A) polymerase: nucleotide specificity, RNA‑binding affinities and RNA structure dependence. Nucleic Acids Res. 2000, 28(5), 1139–1149.