SOFTWARE TOOLS FOR AUTOMATED LC/MS ANALYSIS OF CRITICAL QUALITY ATTRIBUTES OF mRNA MOLECULES

Shrnutí: Softwarové nástroje pro automatizovanou LC/MS analýzu kritických kvalitativních atributů mRNA

Význam tématu

mRNA terapeutika a vakcíny vyžadují přesnou kontrolu klíčových kvalitativních atributů (CQA) — 5'-capping, délky a heterogenity poly(A) ocasu a integritu sekvence. Spolehlivá, rutinně použitelná a automatizovaná analytika těchto parametrů je kritická pro vývoj, výrobní kontrolu a uvolňování šarží. Kombinace vysokorozlišovací LC-MS a specializované informatiky zjednodušuje komplexní charakterizaci velkých RNA molekul a zkracuje dobu analýzy s menší potřebou manuální intervence.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo demonstrovat workflow spojující vysoce výkonnou LC-MS akvizici a tři specializované aplikace (SYNTHETIC Library, MAP Sequence, INTACT Mass) pro hodnocení tří CQA mRNA: (1) 5'-capping efficiency, (2) průměrná délka a heterogenita poly(A) ocasu, (3) integrita sekvence. Studie použila modelový Fluc mRNA konstrukt (1,919 nt + Cap-1 + poly(A)) a kombinaci čtyř endonukleáz pro dosažení rozsáhlého mapování sekvence.

Použitá metodika a instrumentace

• Vstupní vzorek: syntetická Fluc mRNA s Cap-1 a poly(A) ocasem; denaturace před digescí.
• Enzymatické štěpení: použití RNase T1 (3'-G specifická), RapiZyme MC1 (5'-U preferenční), RapiZyme Cusativin (3'-C preferenční) a human RNase4 (3'-U s omezenými místy štěpení). Čas/teplota a jednotky enzymu upraveny dle protokolu (např. RNase T1: 15 min/37 °C).
• Separační podmínky: ACQUITY Premier UPLC (ACQUITY Premier OST 1.7 µm, 300 Å, 2.1 x 150 mm), průtok 0,3 mL/min, gradient 0→50 % B v 90 min, teplota kolony 60 °C.
• Mobilní fáze: Eluent A – 10 mM n-dipropylamin (DPA) + 40 mM HFIP ve vodě (pH ≈ 8.6); Eluent B – stejná složení v 50 % methanolu.
• Hmotnostní spektrometrie: Xevo MRT Q-Tof (multi-reflecting time-of-flight) v režimu MSE (data-independent acquisition), skenování 0,5 s v rozsahu m/z 400–4000; nízká energie CE ~6 V, vysoká energie ramp 30–55 V; dosažené rozlišení ~100 000 a velmi dobrá přesnost hmotnosti (typicky sub-ppm u precursors a fragmentů, obecně <10 ppm pro všechny poly(A) měření).
• Informatika: waters_connect platforma se SYNTHETIC Library v2.0 (in-silico digesce, definice modifikací), MAP Sequence v2.0 (přiřazení produktů štěpení a vyhodnocení fragmentů) a INTACT Mass v1.9 (dekonvoluce a kvantifikace poly(A) variant).

Hlavní výsledky a diskuse

• Komplexní sekvenční pokrytí: kombinací čtyř enzymatických štěpení dosaženo 93.7 % nejednoznačného (unambiguous) pokrytí sekvence mRNA, což ilustruje výhodu multi-enzymatické strategie pro snížení nejistot v přiřazení sekvence.
• 5'-capping: Capping efficiency byla určena jako 100 %. Neobvyklý nález: přítomnost obou Cap-1 forem v populaci — 62.7 % m7GpppAm a 37.3 % m7GpppGm. Analýza proběhla na produktech generovaných hRNase4 a potvrzena iontovými chromatogramy a fragmentací. Nebyly detekovány významné cap-related nečistoty nebo truncace.
• Poly(A) ocas: detekováno deset hlavních polyadenosinových variant (rozsah přibližně 98–107 nt). Průměrná délka vypočtená z deseti nejhojnějších druhů je 102.3 mer; průměrná molekulová hmotnost poly(A)-části ~33 608 Da. Relativní abundances jednotlivých variant byly kvantifikovány dekonvolucí ESI-MS signálu a masová přesnost pro poly(A) druhy byla velmi dobrá (<10 ppm).
• Automatické rozlišení izomerů: MAP Sequence App využívá akceptační kritéria založená na pokrytí fragmenty (příklad: izomer s 100 % frag. pokrytím přijato, druhý s 50 % zamítnut), čímž systém automatizuje rozhodování mezi izobarickými/isomerickými produkty bez manuální kontroly MS2.
• Celkové workflow: jediné LC-MS běhání poskytlo data pro všechny tři CQA hodnocení díky kombinaci MSE akvizice a specializované informatiky.

Přínosy a praktické využití metody

• Integrace dat: jeden analytický běh pokrývá capping, poly(A) charakterizaci i mapování sekvence, čímž se šetří čas a materiál ve srovnání s oddělenými testy.
• Automatizace a reprodukovatelnost: specializované aplikace zjednodušují zpracování dat, automaticky přiřazují digestion produkty, rozlišují izomery a generují výstupy vhodné pro QC reporty.
• Vysoká citlivost a přesnost: MRT Q-Tof poskytuje vysoké rozlišení a přesnost hmotnosti pro rozlišení blízkých oligonukleotidů a poly(A) isoform; to je důležité pro identifikaci drobných modifikací a truncací.
• Zlepšení pokrytí: multi-enzymatický přístup významně zvyšuje pravděpodobnost neambiguitního pokrytí, což je důležité pro validaci sekvence a detekci vzácných chyb.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další rozšíření enzymatických panelů a optimalizace štěpení pro ještě vyšší pokrytí a citlivost na modifikace.
• Hlubší integrace informatiky s LIMS a elektronickými záznamovými systémy pro automatizované reportování v režimu přímé kontroly jakosti (QC) a uvolňování šarží.
• Zvýšení throughputu: kratší chromatografické metody a paralelizace přípravy vzorků umožní zavedení workflow do rutinní výroby.
• Regulační akceptace: standardizace datových výstupů a ověřitelnost výsledků budou klíčové pro použití v regulačních podmínkách.
• Rozvoj algoritmů pro detekci a kvantifikaci nízkopodílných variant a post-transkripčních modifikací (např. přesnější kvantifikace metylací) a rozšíření na delší nebo méně čisté mRNA konstruktů.

Závěr

Prezentované workflow kombinuje vysoce rozlišovací Xevo MRT Q-Tof LC-MS akvizici s třemi specializovanými aplikacemi waters_connect a ukazuje, že jediné LC-MS měření může současně poskytnout spolehlivá data o 5'-capování, průměrné délce/heterogenitě poly(A) a integritě sekvence mRNA. Multi-enzymatický přístup zvyšuje sekvenční pokrytí a informatické nástroje umožňují automatické přiřazení, rozlišení izomerů a kvantifikaci variant, což činí tento postup vhodným pro podporu vývoje a QC mRNA produktů.

Použitá instrumentace

• UHPLC: ACQUITY Premier Binary System s TUV detektorem.
• Kolona: ACQUITY Premier OST, 1.7 µm, 300 Å, 2.1 x 150 mm (P/N 186010541).
• MS: Xevo MRT Q-Tof (multi-reflecting time-of-flight) používaný v MSE režimu.
• Software / aplikace: waters_connect platforma v4.1.0.17; SYNTHETIC Library App v2.0.0; MAP Sequence App v2.0.0; INTACT Mass App v1.9.
• Enzymy: RNase T1 (Aspergillus oryzae), RapiZyme MC1, RapiZyme Cusativin, human RNase4.

Reference

1. Tunable Digestion of RNA Using RapiZyme RNases to Confirm Sequence and Map Modifications, Waters application note P/N 720008539EN, 2024.
2. RNA Digestion Product Mapping Using an Integrated UPLC-MS and Informatics Workflow, Waters application note P/N 720008553EN, 2024.
3. Sequence Mapping of mRNA Digests Using the Xevo MRT Mass Spectrometer and waters_connect MAP Sequence 2.0 Application, Waters application note P/N 720009171EN, 2025.