Higher Throughput Intact Mass Confirmation and Impurity Screening of GLP-1 Analogues Using Multi-Reflecting TOF Technology and INTACT Mass 1.9 Application

Shrnutí aplikace: Rychlé potvrzení intaktní hmotnosti a screening impurit GLP-1 analogů pomocí multi-reflexní TOF technologie a aplikace INTACT Mass 1.9

Význam tématu

Analytika GLP‑1 analogů je kritická pro kontrolu výroby, zajištění integrity produktu a splnění regulačních požadavků. Délka peptidů, chemické modifikace (lipidace, Aib, atd.), a výrobní nečistoty (trunkace, post‑translační nebo procesní varianty) vytvářejí komplexní masové spektra a chromatografické profily. Pro praktické aplikace — screening procesních vzorků, in‑process kontroly či rutinní QC — je nezbytný vysoký průtok, spolehlivá přesnost hmotnosti a automatizované zpracování dat, které minimalizuje manuální přezkum a zrychlí rozhodování.

Cíle a přehled studie

Cílem popsaného workflow bylo demonstrovat univerzální, vysoce průchodnou LC‑MS metodu pro potvrzení hlavní molekuly (intact mass) a simultánní screening nízkoúrovňových impurit v sérii GLP‑1 analogů. Kombinace ACQUITY Premier UPLC, Xevo MRT (multi‑reflecting TOF) a waters_connect INTACT Mass 1.9 byla navržena tak, aby poskytla rychlé (< 1 minuty na vzorek), přesné (sub‑ppm) a automatizované výsledky včetně standardizovaných reportů a flagování odchylek.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika

- Rychlá reverzní fáze s krátkým gradientem optimalizovaným pro dostatečné rozlišení hlavní složky od příbuzných impurit při velmi krátkém čase analýzy.
- Přímé ředění komerčních GLP‑1 analogů (tirzepatid, semaglutid, liraglutid) ve vodě s 0,1 % kyselinou mravenčí; koncentrace 0,001–0,1 mg/mL; bez dodatečného čištění.
- Akvizice v MSE režimu (data‑independent acquisition) umožňující současné sbírání informací MS1 i fragmentačních dat pro případnou retrospektivní sekvenační podporu.

Instrumentace (klíčové komponenty a nastavení)

- LC systém: Waters ACQUITY Premier UPLC System (BSM).
- Kolona: ACQUITY Premier CSH C18, 130 Å, 1.7 µm, 2.1 × 50 mm; teplota kolony 60 °C; teplota vzorku 6 °C; injekční objem 1 µL; průtok 0,8 mL/min.
- Mobilní fáze: voda 0,1 % form. kyselina / acetonitril 0,1 % form. kyselina.
- Detekce UV: 214 nm (TUV).
- MS: Waters Xevo MRT Mass Spectrometer (multi‑reflecting TOF). Režim MSE; rozsah m/z 50–2000; pozitivní ionizace; scan rate 10 Hz; cone 30 V; zdroj 120 °C; desolvace 550 °C; kapilára 2.8 kV; MSE kolizní energie 30–50 eV.
- Software: waters_connect INTACT Mass 1.9 Application s BayesSpray dekonvolucí (monoisotopická hmotnost), adduct consolidation a automatizovaným reportováním; sample submission app v2.7.0 pro hromadné zadávání vzorků a očekávaných formul/mas.

Hlavní výsledky a diskuse

- Rozlišení a přesnost: Xevo MRT poskytl přibližně 100 000 FWHM a konzistentní sub‑ppm přesnost hmotnosti, umožňující diskriminaci blízkých substitučních variant.
- Rychlost a robustnost: platformní metoda fungovala s ~1 minutou akvizice na vzorek bez individuálních úprav přípravy nebo zpracování dat; chromatografie udržela reprodukovatelné RT a úzké šířky píků i při krátkých gradientních bězích.
- Dekonvoluce a limit detekce: BayesSpray monoisotopická dekonvoluce dosáhla vysoké přesnosti a dokázala kvantifikovat minoritní impurity až do ~0,03 % relativní abundance vůči hlavnímu píku.
- Automatizace a review‑by‑exception: INTACT Mass 1.9 poskytl automatické sloučení aduktů, cílené přiřazování známých impurit, označování nově objevených komponent delta‑hmotností a barevně kódovaný přehled (pass/warning/fail), což výrazně snížilo potřebu manuální revize.
- Případová ukázka: u tirzepatidového vzorku byla pozorována monoisotopická chyba ~0.1 ppm; workflow správně přiřadil +Pro, des‑Aib substituci a vyloučil alternativy na základě ppm chyb.

Přínosy a praktické využití metody

- Zrychlení rozhodování: výsledky (potvrzení hlavní hmotnosti, čistota, anotace impurit) dostupné během minuty na vzorek urychlují screeningy v procesu vývoje i QC.
- Snížení variability: standardizované zpracování a automatické konsolidace aduktů minimalizují subjektivní chyby a rozdíly mezi operátory.
- Škálovatelnost: paralelní zpracování a automatizované reporty dovolují spolehlivě zpracovat desítky až stovky vzorků s minimální manuální zátěží.
- Podpora dokumentace: automaticky generované audit‑ready PDF reporty obsahují chromatogramy, dekonvoluovaná spektra, přiřazení složek a metriky čistoty a přesnosti hmotnosti.

Budoucí trendy a možnosti využití

- Rozšíření do QC: metoda je vhodná pro přechod od vývojových k robustním QC testům, pokud jsou splněny validační kritéria pro přesnost, linearitu a opakovatelnost.
- Integrace s dalšími ortogonálními technikami: MSE fragmentační data umožňují retrospektivní podporu sekvenační identifikace; pro definitivní přiřazení modifikací může být vhodné doplnit LC‑MS/MS nebo peptidovou sekvenační analýzu.
- Využití chemických formul v seznamu vzorků: explicitní zadání očekávaných formul zvyšuje kvalitu dekonvoluce při větší variabilitě panelu produktů.
- Další vylepšení algoritmů: pokročilejší modely dekonvoluce a strojové učení mohou dále zlepšit detekci velmi nízkých impurit a automatické přiřazování zmíněných modifikací.

Závěr

Popisovaný workflow kombinuje vysoké rozlišení multi‑reflecting TOF analyzátoru s automatizovaným zpracováním v INTACT Mass 1.9 a poskytuje rychlou, reprodukovatelnou a auditovatelnou platformu pro potvrzení intaktní hmotnosti a screening impurit GLP‑1 analogů. Metoda dosahuje sub‑ppm přesnosti, dostatečné citlivosti k detekci impurit na úrovni ~0,03 % a zkracuje dobu až na ~1 minutu na vzorek, což je výhodné pro vysokoprůchodné screeningy, procesní rozhodování i rutinní QC. Při charakterizaci novelních nebo komplexních variant však doporučujeme kombinovat tento přístup s ortogonálními analytickými metodami pro úplné přiřazení sekvenčních či chemických modifikací.

Reference

1. Fox J., Denbigh L., Berger S. J., Pittman N. Accelerating GLP‑1 Development with High‑Throughput LC‑MS Using the BioAccord LC‑MS System and the INTACT Mass Application. Waters Application Note. 2025.
2. Ahmad S., Singh N., Pargaonkar A., Vig D., Knierman M. LC/MS‑Based Characterization of GLP‑1 Therapeutic Peptide Liraglutide and Its Impurities. Agilent Application Note, 2023.
3. Ranbaduge N., Shion H., Yu Y. Q. Streamlined LC‑MS Analysis of Stress‑Induced Impurities of a Synthetic Peptide Using the BioAccord System and the waters_connect INTACT Mass Application. Waters Application Note. 2022.
4. Waters Corporation. Xevo MRT Mass Spectrometer – Product Information and Technical Overview. Waters, 2024.